支气管肺泡灌洗液涂片抗酸染色、L-J培养、TB-LAMP、Xpert MTB/RIF检测在肺结核诊断中的应用比较

欧维正，刘海兰，雷毅娜，王琼，秦万，游俊飞

1贵阳市公共卫生救治中心，贵阳550003；2贵州医科大学公共卫生学院

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的慢性传染病，据世界卫生组织(WHO)报道，2017年全球约有1 000万例新发患者，其中有640万例新发患者被正式通报给国家有关部门，预估数与报告数之间的差距主要是由于病例漏报以及漏诊造成的[1]。目前，肺结核的诊断主要依靠患者症状、胸部影像学检查及传统的痰涂片抗酸染色、罗氏固体培养(简称“L-J培养”)。但是，肺结核患者的症状及影像学检查往往缺乏特异性，痰涂片抗酸染色的灵敏度及特异度均较低，L-J培养耗时长，以上检测手段均难以满足肺结核早期快速诊断及高病原学阳性率的要求。近年来，WHO先后推荐MTB多色巢式荧光定量PCR(Xpert MTB/RIF)、环介导恒温扩增技术(TB-LAMP)[2]作为快速分子诊断技术应用于临床。在既往报道中，Xpert MTB/RIF、TB-LAMP两种新技术多采用痰液作为检测样本，而以BALF作为检测样本并与传统检测方法进行比较的报道不多。为此，我们进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2019年9月贵阳市公共卫生救治中心住院及门诊送检的BALF样本165例份。参照肺结核诊断标准[3]，165例患者中临床诊断为肺结核131例，其中男70例、女61例，年龄(46.8±19.9)岁，既往感染9例；其他呼吸道疾病34例，其中男20例、女14例，年龄(48.6±20.9)岁，肺癌11例、慢性阻塞性肺疾病5例、肺部感染18例。本研究通过医院伦理委员会审核，患者均签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 涂片抗酸染色 将送检的BALF按检验规程[4]进行抗酸染色检测，抗酸染色试剂购自珠海贝索生物技术有限公司[注册号为粤珠食药监械(准)字2013第1400066号]，严格按照试剂盒说明书进行操作。结果判定标准：连续观察300个不同视野均未发现抗酸杆菌(AFB)定义为AFB阴性(简称涂阴)，连续观察300个不同视野至少发现1条AFB定义为AFB阳性(简称涂阳)。

1.2.2 L-J培养 将送检的BALF用相当于1～2倍样本体积的4% NaOH处理，参照检验规程[4]进行L-J培养，L-J培养基和对硝基苯甲酸(PNB)培养基均购自珠海市银科医学工程有限公司[注册号为粤食药监械(准)字2012第2400717号]，严格按照试剂盒说明书进行操作。结果判定标准：若培养满8周仍无菌生长即报告培养阴性，若培养满8周分离到菌株，则将其参照检验规程[4]进行PNB试验；如菌株在PNB培养基上生长，则鉴定为非结核分枝杆菌(NTM)，反之则为MTB。

1.2.3 TB-LAMP检测 取60 μL BALF放入吸附剂试管中，充分混匀后90 ℃加热裂解5 min。将吸附试管装到样本处理管上，摇晃8～10次后得到初步提取的核酸，在样本处理管上加上滴注盖，轻压样本处理管，将样本滴入到反应管中。试剂干燥于管盖上，盖上管盖，充分混合；67 ℃条件下进行LAMP反应，反应40 min，通过仪器配套的紫外线激发荧光观察反应结果。TB-LAMP试剂购自日本荣研化学株式会社(注册号为国械注进20143405184号)，严格按照试剂盒说明书进行操作。结果判定标准：发出绿色荧光判定为阳性，未发出荧光判定为阴性。

1.2.4 Xpert MTB/RIF检测 取1 mL BALF置于有螺旋盖的前处理管中，加入相当于2倍样本体积的处理液，旋紧前处理管；在涡旋振荡器上涡旋振荡15～30 s，室温静置15 min，使样本充分液化。打开反应盒，取2 mL处理后样品，从加样孔缓慢加入反应盒，将反应盒置于检测模块，使用GeneXpert 检测系统(美国Cepheid公司)进行自动化检测。Gene Xpert MTB/RIF试剂盒购自美国Cepheid公司[注册号为国食药监械(进)字2014第3401153号]，严格按照试剂盒说明书进行操作。反应结束后，直接在检测系统窗口下观察检测结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料以率表示，涂阳与涂阴样本中L-J培养、TB-LAMP、Xpert MTB/RIF检测MTB阳性率的比较采用χ2检验。以临床诊断为金标准，计算L-J培养、TB-LAMP、Xpert MTB/RIF检测MTB的灵敏度、特异度和准确性，灵敏度的比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4种方法的检测结果 165例份BALF样本中，涂阳25例份、涂阴140例份，阳性率15.15%(25/165)；L-J培养阳性40例份、阴性125例份，阳性率24.24%(40/165)，阳性菌株经PNB试验鉴定均为MTB；TB-LAMP检测阳性66例份、阴性99例份，阳性率40.00%(66/165)；Xpert MTB/RIF检测阳性48例份、阴性117例份，阳性率29.09%(48/165)，阳性样本中利福平(RIF)敏感38例份、耐药9例份、不确定1例份。

19例份TB-LAMP检测阳性，Xpert MTB/RIF检测阴性；28例份TB-LAMP检测阳性，L-J培养阴性；1例份Xpert MTB/RIF检测阳性，TB-LAMP检测阴性；11例份Xpert MTB/RIF检测阳性，L-J培养阴性；2例份L-J培养阳性，TB-LAMP检测阴性；3例份L-J培养阳性，Xpert MTB/RIF检测阴性；1例份抗酸染色AFB、TB-LAMP检测阳性，而Xpert MTB/RIF检测、L-J培养阴性。

2.2 涂阳与涂阴样本中L-J培养、TB-LAMP及Xpert MTB/RIF检测MTB阳性率比较 在涂阳样本中，L-J培养、TB-LAMP及Xpert MTB/RIF检测MTB阳性率分别为84.00%(21/25)、100%(25/25)、96.00%(24/25)，3种方法检测MTB阳性率比较P>0.05；在涂阴样本中，L-J培养、TB-LAMP及Xpert MTB/RIF检测MTB阳性率分别为13.57%(19/140)、29.29%(41/140)、17.14 %(24/140)，两两比较P均<0.05。

2.3 L-J培养、TB-LAMP及Xpert MTB/RIF检测对肺结核的诊断效能比较 见表1。

表1 L-J培养、TB-LAMP及Xpert MTB/RIF检测对肺结核的诊断效能

3 讨论

早期准确诊断是TB患者得以及时治疗的关键，提高诊断技术则是发现患者的核心[5,6]。涂片抗酸染色是MTB最传统的检测方法之一，由于操作简单，在实验室中广泛开展，但其灵敏度和特异度不足，易造成误诊和漏诊。L-J培养亦是MTB传统的检测方法，较涂片抗酸染色的灵敏度和特异度有所提高，但检测周期长(4～8周)是其应用受限的主要原因。目前，新型分子诊断技术在全球广泛开展，TB-LAMP和Xpert MTB/RIF检测以其简便、快捷、灵敏度高的特点受到高度关注。TB-LAMP检测是一种新型的核酸恒温扩增技术，不依赖温度循环变化，只需恒定温度就能扩增反应。其原理主要是对MTB DNA上gyrB基因和IS6110基因的6个区域设计4条特异性引物，利用链置换反应，对目标DNA进行大量扩增，检测结果可在1 h内完成[7]。Xpert MTB/RIF采用半巢式全自动实时荧光定量PCR原理，将样品处理、核酸扩增、目标序列的实时检测整合于一体，通过对MTB DNA特有的序列rpoB基因上RIF耐药相关81 bp的核心区域(RRDR)进行检测，可同时检测MTB和RIF耐药性[8]，标本处理完上机2 h内可获得检测结果。

现阶段我国约有70%涂阴肺结核患者[9]，其临床症状不明显，咳痰少甚至没有，故很难留取合格的痰液样本。支气管镜检查可采集得到BALF，其具有污染率低(采集不经过口腔和咽喉)、菌含量高(灌洗部位为病灶所在的肺叶、肺段)的优点，是理想的病原学检测样本，对其进行检测可增加MTB阳性检出率，进而提高对肺结核的诊断效能。但单纯地依靠传统方法检测，仍然难以满足肺结核病原学诊断的需求。本研究对165例BALF样本同时采用4种方法检测，涂片抗酸染色阳性率最低，显示该方法检测的灵敏度较差；对于涂阴样本，TB-LAMP检测阳性率高于L-J培养和Xpert MTB/RIF检测。该结果与张伟阳等[10]、刘权贤等[11]应用上述方法检测痰液样本的结果一致。虽然L-J培养对涂阴样本的检测阳性率也有较大提高，但是该方法耗时长，远不及TB-LAMP和Xpert MTB/RIF的快速检测具有优势。

MTB传统检测方法不仅灵敏度低，还不能区分MTB和NTM，抗酸染色和L-J培养阳性也需要进一步进行菌种鉴定。本研究L-J培养的40例份阳性菌株虽然经PNB鉴定全为MTB，但也有鉴定为NTM的报道[12]。TB-LAMP和Xpert MTB/RIF检测均是以MTB基因组中保守的管家基因作为检测靶标，保证了检测结果的特异性。本研究以临床诊断为金标准，TB-LAMP、Xpert MTB/RIF检测及L-J培养诊断肺结核的特异度均为100%，但TB-LAMP检测诊断肺结核的灵敏度明显高于Xpert MTB/RIF检测和L-J培养。孙娇[13]等研究显示，TB-LAMP和L-J培养的灵敏度差异有统计学意义。虞忻等[14]研究显示，Xpert MTB/RIF和L-J培养的灵敏度差异无统计学意义。以上均与本研究结果相符。有文献报道，以单拷贝基因为检测靶标的方法比以多拷贝基因为检测靶标的方法灵敏度低[15]。TB-LAMP的检测靶标为多拷贝基因IS6110和单拷贝基因gyrB，因此比只有1个单拷贝基因rpoB作为检测靶标的Xpert MTB/RIF灵敏度高。另外，TB-LAMP没有如PCR变性、退火和延伸等温度循环步骤，扩增效率明显提高[16]。以上可能是TB-LAMP诊断肺结核的灵敏度高于Xpert MTB/RIF的原因。不同于TB-LAMP和Xpert MTB/RIF死菌活菌都能检测，L-J培养只能检测活菌。如果存在样本碱处理不当或者培养基营养不良等外在因素，均有可能导致L-J培养的检测灵敏度降低。

本研究结果显示，部分样本采用不同的检测方法得到的结果也不同，除上述原因外，L-J培养阳性而TB-LAMP和(或)Xpert MTB/RIF检测阴性的情况，或许是因为样本载菌量少且受本身方法取样量限制而导致的[13]。说明任何一种方法都有其局限性，多种方法联合检测可提高肺结核的病原学诊断率。本研究样本数量有限，没有分子生物学假阳性的结果，但不排除分子生物学检测技术因方法学本身的局限性而导致的假阳性，严格控制实验室污染是分子生物学检测技术取得可靠结果的关键。

综上所述，BALF中涂片抗酸染色阳性率最低，只适合肺结核的初筛；L-J培养和TB-LAMP、Xpert MTB/RIF检测均能大幅提高涂阴肺结核的病原学诊断率，其中TB-LAMP检测的阳性率及其诊断肺结核的灵敏度最高。