柑橘大实蝇滞育蛹海藻糖酶和山梨醇脱氢酶活性的动态变化

周志雄　袁江江　李世香　梁玲　李传仁

摘要 柑橘大实蝇Bactrocera minax （Enderlein）是我国西南和华中地区柑橘的主要害虫，以滞育蛹在土壤中越冬。为探讨温度对柑橘大实蝇滞育蛹生理状态的影响，本文测定了12、16、20℃和24℃下柑橘大实蝇滞育蛹海藻糖酶和山梨醇脱氢酶活性的变化。结果显示，低温（12℃）下，海藻糖酶活性逐渐上升，高温（24℃）下，海藻糖酶活性逐渐下降;不同温度下山梨醇脫氢酶活性变化不尽相同，在起始阶段（10 d时），柑橘大实蝇滞育蛹山梨醇脱氢酶活性普遍较强，随滞育时间的延长，酶活性出现不同的变化，12℃和20℃下，山梨醇脱氢酶活性呈现“U”形变化趋势，16℃下酶活性逐渐减弱，24℃下酶活性先升后降。16℃下，两种酶活性基本低于同时期其他温度处理。交互作用分析显示，温度和化蛹后天数的交互作用对滞育蛹海藻糖酶和山梨醇脱氢酶活性存在显著影响。上述结果表明，柑橘大实蝇自身生理状态应对不同越冬温度的反应不同，说明越冬温度与柑橘大实蝇滞育期生理水平有着密切的关系。本研究结果对深入了解温度调控柑橘大实蝇滞育期代谢生理机制有一定的参考价值。

关键词 柑橘大实蝇; 滞育; 越冬温度; 海藻糖酶; 山梨醇脱氢酶

中图分类号： S 436.661， Q 965

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019241

Activity of trehalase and sorbitol dehydrogenase of the Chinese citrus fruit fly， Bactrocera minax （Enderlein） during diapause period

ZHOU Zhixiong， YUAN Jiangjiang， LI Shixiang， LIANG Ling， LI Chuanren*

（Institute of Entomology， Yangtze University， Jingzhou 434025， China）

Abstract

Bactrocera minax （Enderlein） is an important citrus pest in southwestern and central China， which overwinters as pupae in diapause in the soil. To investigate the effects of overwintering temperature on the physiological state of the Chinese citrus fruit fly during diapause， the changes in the activity of trehalase and sorbitol dehydrogenase of the Chinese citrus fruit fly overwintering at 12， 16， 20 and 24℃ during diapause period were determined. The results showed that the activity of trehalase gradually increased at lower temperature （12℃）， and decreased gradually at higher temperature （24℃）. Under different overwintering temperatures， the activity of sorbitol dehydrogenase was different. At the initial stage of diapause （10 d）， the activity of sorbitol dehydrogenase was generally higher. With the prolongation of days after pupation， the enzyme activity exhibited different changes. At 12℃ and 20℃， the activity of sorbitol dehydrogenase showed a “U” type change trend， and gradually decreased at 16℃， and rose and then dropped at 24℃. At 16℃， the activities of these two enzymes were basically lower than at other temperatures in the same time. Interactive analysis showed that temperatures and days after pupation had a significant effect on the activity of trehalase and sorbitol dehydrogenase of B.minax pupae in diapause. These results indicated that the physiological state of the Chinese citrus fruit fly had different responses to different overwintering temperatures， and the overwintering temperature was closely related to the physiological level of the Chinese citrus fruit fly during diapause period. The present work provides a reference for understanding the regulation of physiological metabolism of the Chinese citrus fruit fly in diapause by overwintering temperatures.

Key words

Bactrocera minax; diapause; overwintering temperature; trehalase; sorbitol dehydrogenase

柑橘大实蝇Bactrocera minax （Enderlein）俗称“柑蛆”，是我国西南和华中地区柑橘的主要害虫，能够严重影响柑橘果实的产量和品质[1-3]。柑橘大实蝇为一化性昆虫，以专性滞育（化蛹后开始进入滞育状态）蛹在土壤中越冬，滞育期长达4～5个月，滞育解除后继续发育一个月左右，在翌年4月下旬至5月上旬成虫开始羽化，6月中旬开始在柑橘果实中产卵，8月中旬幼虫孵化后为害果实[2-5]。

滞育是昆虫为了躲避不良环境而中止发育的一种适应行为[6-7]，在滞育过程中昆虫以最经济的能量利用方式进行较缓慢的生命活动来度过漫长的滞育期。海藻糖和山梨醇是滞育昆虫体内存在的两种重要物质，作为昆虫的“血糖”，海藻糖既能作为能量物质来源，也能协助细胞抵御多种环境胁迫[8-13]，昆虫体内唯一可以降解海藻糖的海藻糖酶能将一分子海藻糖分解成为两分子葡萄糖，再进一步通过糖酵解为昆虫提供能量[14-16]。同样，山梨醇也能作为昆虫越冬期抗寒物质，在山梨醇脱氢酶的作用下转化成糖原，为昆虫滞育期提供能量。因此，海藻糖酶和山梨醇脱氢酶对昆虫滞育期能量代谢的调控起到极其重要的作用。迄今为止，对昆虫滞育研究的结果表明，昆虫体内海藻糖酶和山梨醇脱氢酶是其滞育起始和终止阶段的2个关键性酶[17]。

研究表明，温度是影响柑橘大实蝇越冬存活的主要因子之一，温度过高（30℃以上）或过低（10℃以下）均不利于柑橘大实蝇蛹的存活和成虫的羽化[5]，15～20℃是柑橘大实蝇越冬的适宜温区[18]。为深入了解柑橘大实蝇越冬蛹在滞育过程中体内化学物质代谢变化规律，本文研究了柑橘大实蝇滞育蛹在12、16、20℃和24℃条件下越冬其体内海藻糖酶和山梨醇脱氢酶活性的变化，为柑橘大实蝇越冬蛹滞育代谢生理机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2016年10月初，从湖北松滋市温州蜜柑园采集落地蛆果，在实验室剥出落果中柑橘大实蝇幼虫。在采集供试虫源之前，先将河沙烘干，然后添加蒸馏水将河沙湿度调至15%～20%，再将湿河沙盛于直径20 cm的花盆中;将柑橘大实蝇幼虫置于室内装有湿河沙的花盆中自然化蛹，每隔2 d检视花盆中柑橘大实蝇的化蛹进度并捡出蛹，以前后2次捡出的蛹为同期蛹。

1.2 试验处理

以第2次捡出蛹的时间为起始点，选取两次化蛹、体型相近的同期滞育蛹800头，立即随机分成4组，按50头/盆分别置于12、16、20℃和24℃光照培养箱（L∥D=14 h∥10 h）中饲养，并保持花盆中河沙湿度在15%～20%之间。在化蛹后10、30、70 d和110 d收集各温度处理下的滞育蛹20头，用蒸馏水冲洗干净，吸水纸吸干后称重。用液氮冷冻后置于-80℃冰箱保存待测，但鉴于柑橘大实蝇蛹在24℃条件下的滞育蛹期仅持续50 d左右，故该处理下仅收集化蛹10、30 d和50 d的样品。

1.3 柑橘大实蝇滞育相关酶活性测定

酶液的制备：取每处理越冬蛹，称量后于冰浴中迅速研磨，加5 mL预冷缓冲液。海藻糖酶的缓冲液为磷酸盐缓冲液（PBS，pH 5.8），山梨醇脱氢酶的缓冲液为0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.8，内含Tris 0.2 mol/L，MgCl2 25 mmol/L， NaN3 15 mmol/L）。样品在冰浴中匀浆，匀浆液于4℃下16 000 g（Eppendorf Centrifuge 5810 R）离心10 min，取上清液作为酶液[19]。

海藻糖酶和山梨醇脱氢酶活性的测定分别参考李志刚等[19]和Negm等[20]的方法，采用紫外分光光度计（Beckman Coulter DU-730）分别在550 nm和340 nm测定吸光值。每处理重复4次。两种酶活性以每分钟每毫升反应液的吸光度变化值为活性单位（OD/（mL·min））。

1.4 數据处理

所有试验数据均采用SPSS（SPSS Inc.， Chicago， USA）数据处理系统进行分析。所得柑橘大实蝇滞育蛹两种酶活性数据进行单因素方差分析和双因素方差分析，平均数差异均采用Tukey法多重比较。

2 结果与分析

2.1 海藻糖酶活性的变化动态

温度和化蛹后天数综合作用下柑橘大实蝇滞育蛹海藻糖酶活性如图1所示。温度和化蛹后天数对柑橘大实蝇滞育蛹海藻糖酶活性均有显著影响，两因素交互作用也存在显著影响（表1）。

在相同温度下，滞育蛹海藻糖酶活性随化蛹后天数而变化。在12℃条件下，滞育蛹海藻糖酶活性随化蛹后天数逐渐增强，在110 d时活性最强;16℃下，海藻糖酶活性随化蛹后天数先增后减，在30 d时最高，110 d时最低;20℃时，海藻糖酶活性在滞育期呈现升-降-升的变化模式，在30 d时酶活性达到最强，70 d时活性最弱;24℃时，酶活性强度随化蛹后天数逐渐减弱，且10 d时酶活性显著强于30 d和50 d，30 d和50 d之间无显著差异（图1）。

在相同滞育期，滞育蛹海藻糖酶活性随温度而不同。处理10 d后，海藻糖酶活性随温度升高先减后增，24℃下酶活性显著高于其他温度;处理30 d后，20℃下酶活性最高，显著高于12℃和16℃的酶活性;70 d时，海藻糖酶活性随温度升高呈现降-升的变化趋势，16℃条件下酶活性最低，12、16和20℃之间酶活性无显著差异;110 d之后，海藻糖酶活性随温度升高呈现降-升的变化趋势，在16℃下酶活性显著低于12℃和20℃，12℃和20℃之间无显著差异（图1）。

以温度和化蛹后天数作为单一因子分析后发现，不同温度条件比较，16℃条件下柑橘大实蝇滞育蛹海藻糖酶活性最低，显著低于20℃和24℃，24℃条件下酶活性最高（图2a）;化蛹后不同天数比较，70 d时酶活性最低，且显著低于10 d和30 d，10 d时酶活性最高（图2b）。

2.2 山梨醇脱氢酶活性的变化动态

柑橘大实蝇滞育蛹山梨醇脱氢酶活性随温度和滞育期的变化动态如图3所示。温度和化蛹后天数对柑橘大实蝇滞育蛹山梨醇脱氢酶活性均有显著影响，两因素交互作用也存在显著影响（表1）。

在相同温度下，滞育蛹山梨醇脱氢酶活性随化蛹后天数而变化。由图3可见，不同温度下，随化蛹后天数增加，山梨醇脱氢酶活性变化趋势不同。12℃下，山梨醇脱氢酶活性基本维持不变，30 d时酶活性最低，110 d时酶活性最高;16℃下，30 d之前酶活性无显著变化，30 d后酶活性显著降低;20℃条件下，山梨醇脱氢酶活性随化蛹后天数呈现“U”形变化趋势，10 d时活性最强，之后酶活性逐渐降低，70 d时酶活性最低，随后缓慢增强;24℃时，滞育期酶活性呈倒“U”形变化，在30 d时酶活性最强。

在相同滞育期，滞育蛹的山梨醇脱氢酶活性随温度变化而不同。处理10 d后，山梨醇脱氢酶活性强度顺序为20℃>24℃>12℃>16℃，其中20℃时活性显著高于12℃和16℃，12℃、16℃和24℃之间无显著差异;30 d后，20℃下酶活性最低，24℃下酶活性最高并显著高于12℃、16℃和20℃下的酶活性;处理后70 d和110 d，16和20℃条件下滞育蛹山梨醇脱氢酶活性显著低于12℃，且16℃下酶活性最低，酶活性随温度升高呈现降-升的变化趋势。

以温度和化蛹后天数作为单因子分析结果如图4所示。16℃条件下滞育蛹山梨醇脱氢酶活性最低，显著低于12、20℃和24℃，24℃条件下酶活性最高（图4a）;不同时期中，70 d时酶活性最低，且显著低于10 d和30 d，10 d时酶活性最高（图4b）。

3 讨论

在滞育期，昆虫主要通过消耗自身储存的能量物质来维持生命活动，作为昆虫的“血糖”，海藻糖在昆虫生命活动中发挥着极其重要的作用[12]。本文测定了滞育期不同温度下柑橘大实蝇蛹海藻糖酶活性的变化。结果表明，不同温度下，海藻糖酶活性变化趋势不尽相同，在滞育起始阶段，海藻糖酶活性与温度呈正相关，处理10 d后，各温度下海藻糖酶活性变化趋势不同，说明柑橘大实蝇在滞育期应对不同恒温越冬条件的反应不同。在自然条件下，滞育期柑橘大实蝇海藻糖含量呈现升-降的变化趋势，且海藻糖酶活性变化也呈现升-降的趋势[21]，本研究中低温和高温越冬条件下，随化蛹后天数增加海藻糖酶活性分别逐渐升高和降低。因此，在柑橘大实蝇体内海藻糖含量的高低可能与海藻糖酶活性的变化并非呈现相关关系[12，22]，同时，作为抗寒物质，在柑橘大实蝇体内，海藻糖可能不是主要的抗寒物质，但海藻糖酶在滞育起始阶段之后的作用有待进一步研究。

山梨醇是生物体内重要的抗逆物质之一[17]。大量研究表明，许多滞育昆虫体内山梨醇的含量变化与其滞育的开始、维持和解除存在密切的关系[23]。其能够催化山梨醇脱氢转化成糖原，而糖原是滞育昆虫重要的营养物质，因此，山梨醇脱氢酶在昆虫滞育中有着重要作用。本文研究结果表明，不同越冬温度条件下，滞育期蛹山梨醇脱氢酶活性变化趋势不尽相同。在滞育起始阶段（10 d时），柑橘大实蝇越冬蛹体内山梨醇脱氢酶活性普遍较强，随化蛹后天数的增加，酶活性出现不同的变化，可能在滞育起始期，越冬蛹体内山梨醇被转化成其他物质来保证滞育开始的物质需求。10 d之后，酶活性变化趋势不同，与滞育期温度无明显的相关性。

山梨醇脱氢酶作为滞育解除过程中的关键酶[17]，在滞育解除阶段，山梨醇在山梨醇脱氢酶的作用下转化成糖原，进而分解作为昆虫生长发育的能源物质。因此，在柑橘大实蝇越冬蛹的滞育后期可能会出现山梨醇脱氢酶活性上升的阶段。本文研究结果中，在16℃和24℃条件下，在滞育后期，山梨醇脱氢酶活性未出现上升的变化，并且在12℃条件下，110 d时酶活性未出现显著的上升。这一情况可能与柑橘大实蝇滞育解除时间有关，12℃和16℃条件下越冬时，滞育解除时期可能在110 d之后，在20℃下越冬，滞育解除期可能在70～110 d之间，而在24℃下越冬时，滞育解除期可能在30～50 d之间，因此，在12℃和16℃条件下越冬110 d之后，山梨醇脱氢酶活性可能会出现显著上升。这与温度调控柑橘大实蝇越冬蛹的发育可能存在密切的关系。

本试验结果表明，在低温（12℃）和高温（20℃和24℃）条件下越冬，柑橘大实蝇越冬蛹海藻糖酶和山梨醇脱氢酶活性基本高于同时期在16℃下越冬个体，且在16℃下，随滞育期的延长，虫体两种酶活性基本呈现逐渐下降的趋势，由此可以看出，在16℃下越冬，越冬个体可能对海藻糖和山梨醇需求程度逐渐减弱，且可能在此条件下越冬，虫体会出现海藻糖和山梨醇的积累，同时为滞育解除后的发育提供能量保證。

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（责任编辑：田 喆）