清热解毒汤对大肠埃希菌的体外抑菌作用研究

王 晶，孙兰菊，房 杰，孔 棣，陈明慧

抗生素的使用使很多细菌感染性疾病得到有效控制，然而，随着抗生素的广泛应用，细菌耐药已成为极其严重的世界性问题。目前几乎所用的抗菌药物均出现了耐药菌株[1]，人类正面临着所谓的“抗生素危机”，其本质是“抗生素耐药危机”[2]。随着抗生素长期大量的应用，对人体产生的不良反应也越来越多。中药的单纯抑菌作用虽不及抗生素，但因其多作用机制，仍然在抗细菌感染方面发挥协同和补充加强的作用，为耐药菌感染治疗提供了新的用药方向。本研究拟就吴咸中院士提出的中药板块方剂之一清热解毒汤（大黄、黄芩、白头翁、败酱草）对临床常见腹部感染致病菌产超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-lactamase，ESBLs）的大肠埃希菌的体外抑菌作用进行初步探究，为临床该类耐药菌感染的中药治疗提供理论根据。

1 材料与方法

1.1 菌株 天津南开医院临床标本中分离获得的细菌，经常规培养后用生物梅里埃公司的VITEKAMS30鉴定系统鉴定为大肠埃希菌。且经ESBLs测定，确定为ESBLs阳性菌株。具体方法为：采用CLSI2015年推荐的方法进行测定，将头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸，头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸药敏纸片分别贴在同一个均匀涂布了待检菌的M-H琼脂上，35℃培养18～24 h。若任何一组含克拉维酸的纸片与相应不含克拉维酸的纸片抑菌环直径差值≥5 mm，确定为ESBLs阳性菌株。

1.2 药材 药材饮片由天津市南开医院中药制剂室提供。清热解毒汤方剂组成为：大黄10 g，黄芩10 g，白头翁15 g，败酱草15 g。四味中药分煎获得药物浓度均为1.0 g/mL，组方的药物浓度亦为1.0 g/mL，置-20 ℃冰箱保存。

1.3 方法

1.3.1 抗生素药敏检测 采用美国临床实验室标准委员会（CLSI）推荐的K-B法进行。将接种在营养琼脂平皿上的菌种于35 ℃培养18 h后，配制成浓度为0.5麦氏单位的菌悬液，均匀涂布到M-H琼脂平皿上，贴抗生素药敏纸片，35 ℃培养18 h后观察结果，药敏参考CLSI 2015年标准判读结果。

1.3.2 清热解毒汤浓度的稀释 原液为1000 g/L，使用灭菌注射用水，将原液进行倍比稀释，浓度 分 别 为：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91及1.95 g/L，各取5 mL置无菌管内备用。

1.3.3 培养基的制备 采用M-H琼脂，按厂家规定进行配置时，加水量减少25%，以备留给稀释好的中药进行补充。将培养基121 ℃15 min高压灭菌后，冷却至48～50 ℃时，取琼脂20 mL和一个浓度的中药稀释液5 mL，充分混匀，倾注至直径为90 mm的无菌平板。另取琼脂20 mL和灭菌注射用水混匀后，倾注至直径为90 mm的无菌平板，作为空白对照。充分干燥后，放入4～8 ℃冰箱保存，备用。

1.3.4 体外抑菌试验 随机留取92株产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌及1株大肠埃希菌标准菌株ATCC25922。将贮藏菌种接种在营养琼脂平皿上，35 ℃培养18 h后，配制成浓度约为1.5×107/mL的菌悬液，用定量环接种，每环含2 μL菌液，分别接种于含不同药物浓度的琼脂平板上及不含中药的空白对照平板上。置室温让菌液充分吸收后，置于35 ℃温箱内孵化过夜，培养18～24 h观察结果。

1.3.5 药敏结果的判读 若空白对照平皿上细菌全部生长，观察接种菌的中药平板上无细菌生长即中药发挥了抑菌作用，则此平板的中药浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。

1.4 统计学方法 采用whonet 5.6软件进行数据分析。

2 结果

2.1 抗生素药敏试验 92株产ESBLs的大肠埃希菌对临床常用抗生素的药物敏感率总体并不是很高，不同程度地出现了对抗生素的耐药，其中对氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛和头孢噻肟的耐药率均为100%，见表1。

表1 92株产ESBLs的大肠埃希菌对常见抗菌药物的敏感率

2.2 清热解毒汤对标准菌株的抑菌效果 标准菌株ATCC25922 的MIC为62.5 g/L（1/16倍稀释），可见1000、500、250、125、62.5 g/L的清热解毒汤对该标准菌株有抑菌作用。

2.3 清热解毒汤对临床分离的产ESBLs的菌株的抑菌效果 92株产ESBLs大肠埃希菌中有10株中药的MIC值为250 g/L（1/4倍稀释）、29株MIC为 125 g/L（1/8倍稀释）、45株MIC为62.5 g/L（1/16倍 稀 释 ）、8株 MIC为 31.25 g/L（1/32倍稀释），说明不同浓度的清热解毒汤对产ESBLs的大肠埃希菌有不同程度的抑菌作用，而15.63 g/L（1/64倍稀释）及以下更低浓度的中药对菌株未见抑菌作用，见表2和图1。

表2 清热解毒汤对产ESBLs大肠埃希菌的最低抑菌浓度

图1 清热解毒汤对产ESBLs大肠埃希菌的抑菌效果

3 讨论

实验结果显示清热解毒汤对产ESBLs大肠埃希菌在体外有确切抑制作用。在92株产ESBLs大肠埃希菌对4种抗生素出现全部耐药的情况下，不同浓度的清热解毒汤均有不同程度的抑菌作用，而且在MIC值为62.5 g/L（1/16倍稀释原中药液）时即已呈现出对多数菌株的抑菌能力，与国内相关报道一致[3]。

近年来，随着抗生素的长期大量应用，细菌对抗生素的耐药问题日趋严峻[4]，目前普遍认为细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要是产生了β-内酰胺酶，一种能将β-内酰胺类抗生素分解成无抑菌活性产物的酶，从而使细菌产生耐药性[5-6]。因此寻找、开发新的抗细菌耐药或防细菌耐药的药物成为当务之急。然而抗生素新药的研发速度远远比不上耐药菌株形成的速度，而且研制一个新的抗生素所花费的时间和成本都非常之大。在这种情势下，我们应当充分利用祖国医学的丰富资源。很多中药的抗感染作用历经上千年临床循证，确实有效，尤其是中药的多作用机制，一般在临床不易形成耐药[7-8]。清热解毒汤组方中的大黄、黄芩、白头翁、败酱草的药物成分中均具有抗炎抑菌作用的有效成分，虽然该实验结果表明本方剂对多重耐药的产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌的体外抑菌作用较好，但有研究表明，将几种有临床疗效的中药与西药的MIC进行比较，几种中药的体外MIC值远远达不到现代医学对抗感染的评价要求[9]，提示不能仅从体外抑菌的实验效果单纯去评价中药在人体中抗感染的作用，还必须采用全新的方法去准确评价中药抗细菌感染的临床疗效。对产ESBLs引起感染的治疗，近年来研究较多[10-11]，但大多数抗生素价格昂贵，而且不良反应较多，易造成肝肾功能损害或出现二重感染（如深部真菌感染）等，而中药除不良反应较小，不易产生耐药性外，还能通过调节机体的整体免疫反应和改变机体的局部微环境条件，从而达到清除病原菌，提高临床疗效的目的[12-13]，此外，中药抗菌还具有多靶点的特点[14]。

目前已证实多种清热解毒类中药具有抑菌作用，但清热解毒药整方的抑菌作用研究却少见报道，本研究对大黄、黄芩、白头翁、败酱草组成的清热解毒方剂的抑菌作用进行研究。随着中药抑菌作用的研究方法和手段不断改善提高，中药抑菌作用的研究还应从体外抑菌实验向体内抑菌实验发展，以揭示中药抑菌作用的具体机制。