维甲酸诱导N2A 细胞分化过程中CD2AP对突触可塑性的调控

刘德山 陈佃福 张旭

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种常见的、与老化密切相关的神经系统变性疾病,其发病率却逐年升高［1］,AD 预期的发病率将达到2001年的300%［2］。迄今已发现多个AD 的致病基因,如APP 基因、早老素基因1(PS1)和早老素基因 2(PS2)等,国际上多个研究团队通过全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study,GWAS)发现了一系列散发性AD 的易感基因［3,4］,前期研究提示CD2AP 表达水平下降可能参与AD 的发病［5］。目前国内外对CD2AP 在肾脏疾病中的致病机制研究较多,发现其参与多个信号通路并在维持细胞骨架中起着重要作用［6］。近期有国内外研究［7］以及本团队前期的研究均提示CD2AP 参与AD的病理过程,但其在AD 发病中的具体机制仍不清楚。

突触相关的结构组成主要包括Actin 细胞骨架、突触后致密物质(postsynaptic dentisy,PSD)、谷氨酸受体等神经递质受体和一些信号蛋白分子等。在研究中发现应用全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)干预N2A 细胞后,发现CD2AP 的表达明显升高,N2A 细胞神经突起明显变长,转染过表达CD2AP 后,神经突起显著变长,而转染shRNA 下调CD2AP 的表达水平后,神经突起显著变短,提示CD2AP 在神经元骨架的形成中起着重要作用,提示CD2AP 可能在神经元突触可塑性中起着重要作用。有研究报道神经元受损后在神经营养因子的作用下,CD2AP 可参与影响神经元骨架蛋白Actin 及受体的内吞作用。CD2AP 作为信号通路与细胞骨架重要的联系分子,可与微丝骨架结合蛋白相互作用,在谷氨酸的诱导下,参与突触形成、迁移等过程,本研究将通过体外ATRA 诱导N2A 细胞神经突起的生长,探讨CD2AP 如何调节神经突触的生长,为后续深入研究CD2AP 如何调控突触可塑性提供重要理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 ①细胞系：SH-SY5Y 细胞：购自中国科学院上海细胞所；N2A 细胞：本实验室保种。②病毒：shRNACD2AP：山东维真公司；overexpressionCD2AP：上海吉凯公司。

1.2 方法

1.2.1 ATRA 干预N2A 细胞 复苏N2A 细胞应用ATRA 干预(干预浓度为20 μmol/L,干预时间为5 d)后,密切观察细胞状态,继续后续实验。

1.2.2 病毒转染 利用维真公司包装的shRNACD2AP病毒和吉凯公司overexpressionCD2AP 病毒进行转染；感染约72 h,观察感染效率,进行后续实验。

1.2.3 细胞免疫荧光 细胞爬片经处理后,放入12 孔板各孔中并于多聚赖氨酸进行包被。在转染前1 d 铺细胞(N2A),每孔铺约1×105个细胞。第2 天转染病毒或进行ATRA 干预、转染或干预后进行细胞免疫荧光染色。

1.2.4 Western blot 从培养箱中取出细胞,抽提的总蛋白,采用Bradford 法测定蛋白质浓度,电泳、转膜后用封闭液稀释抗体［兔抗CD2AP单克隆抗体(1∶1000)、鼠抗GAPDH(1∶1000)、鼠抗β-actin(1∶1000)］,孵育4℃过夜,用TBST 洗膜,再用封闭液稀释相应的二抗,室温下孵育1 h,TBST 洗膜后,采用Millipore 公司ECL化学发光试剂盒进行显色,应用Image Lab 软件进行化学发光成像、分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS14.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。Western blot 数据以均数±标准差(±s)表示,进行Levene 方差齐性检验,方差齐时,组间两两比较采用LSD-t 检验；方差不齐时,采用Games-Howell 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

ATRA 诱导N2A 细胞后,CD2AP 的表达明显升高,N2A 细胞神经突起明显变长；上调、下调N2A 细胞中的CD2AP 后,细胞突起显著变长,ATRA 通过调控CD2AP 表达影响神经突起生长。

CD2AP 参与生长因子信号的蛋白复合物的支架,CD2AP mRNA 和蛋白在大脑中均有表达,Allen 脑图谱表明CD2AP mRNA存在于特定区域的成年大鼠大脑中,特别是具有可塑性高的区域,为了确定CD2AP 是否参与对神经突触生长的调节,在应用ATRA 进行干预(干预浓度为20 μmol/L,干预时间为5 d)的N2A 细胞中检测了CD2AP 的表达情况。免疫荧光结果表明,N2A 细胞应用ATRA 干预后,其神经突起长度明显变长。见图1。同时,Western blot 法检测结果表明ATRA 干预后,CD2AP 蛋白表达水平呈显著升高。结果表明CD2AP蛋白水平受到ATRA 的正调控,并在N2A 细胞神经突起生长过程中起着重要作用。

为进一步研究CD2AP 对神经突起生长的调控,应用shRNACD2AP 和overexpressionCD2AP 两种病毒分别对N2A 细胞进行上调和下调CD2AP 蛋白水平的干预。72 h 后,overexpressionCD2AP 转染Western blot 检测发现CD2AP 的表达量呈显著升高,细胞神经突起长度明显变长。见图2。相反的,转染shRNACD2AP 介导的CD2AP 表达减少导致了与蛋白质的减少程度一致的神经突起的长度显著降低。见图3。结果显示,CD2AP 蛋白可能参与了神经突起生长的调控。

图1 在N2A 细胞分化突起生长过程中CD2AP 表达水平显著升高

图2 overexpressionCD2AP 干预N2A 细胞后CD2AP 表达水平显著升高、神经突起显著变长

图3 shRNACD2AP 干预N2A 细胞后,N2A 细胞CD2AP 表达下调、神经突起变短

3 讨论

AD 其主要临床表现为慢性、进行性认知功能损害,其起病隐袭,初始症状表现为记忆力缺失,症状会随着病情进展逐渐加重,认知和记忆功能不断恶化,AD 患者认知功能下降主要与突触功能的异常相关,且突触功能紊乱常常早于突触的丢失。突触前和突触后相关蛋白均出现不同程度的下降,而且与认知功能的下降明显相关,可见突触功能的正常运转以及维持与突触相关蛋白的正常表达密不可分。突触相关蛋白是突触可塑性重要的分子基础。有研究报道包括突触结构和功能的变化是AD 患者和AD 转基因小鼠模型脑部最早出现的表型,并且突触水平的变化和认知功能损害的程度密切相关。而与突触相关的结构组成主要包括Actin 细胞骨架、突触后致密物质、谷氨酸受体［主要包括N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)］等神经递质受体和一些信号蛋白分子等。影响上述分子和信号通路的因素均可能影响突触的结构和功能,进而可影响突触可塑性。

在本研究中,应用ATRA 干预N2A 细胞后,发现CD2AP 的表达明显升高,N2A 细胞神经突起明显变长,转染overexpressionCD2AP 病毒后,CD2AP 过表达,神经突起显著变长,而转染shRNA 下调CD2AP 的表达水平后,神经突起显著变短,提示CD2AP 在神经元骨架的形成中起着重要作用。这和既往在肾病研究中报道的CD2AP 对调节足细胞的骨架结构起着关键作用的结果相一致［5］,提示CD2AP 可能在神经元突触可塑性中起着重要作用。

总之,ATRA 干预N2A 细胞后可上调CD2AP 的表达,或者overexpressionCD2AP 转染细胞上调CD2AP的表达后,都可促进N2A 细胞神经突起的生长,而shRNACD2AP 下调CD2AP 的表达后,神经突起显著变短,进而说明CD2AP 在神经突触生长过程中起着重要的作用,目前有大量的研究表明AD 患者认知功能下降,其主要原因是突触功能障碍［6,7］。这些结果对理解CD2AP 基因增加AD 易感性的特点提供了重要信息,从而为深入研究CD2AP 增加AD 易感性的发生机制获得一点启示,同时也为今后的研究提供了依据,在后续的研究中进一步深入探讨CD2AP 调控突触可塑性的信号通路。