3种常绿树挥发物成分对空气负离子及微生物的影响

赵亚红，徐翠霞，马 玲，王 彬，韦赛君，吕嘉欣，高 岩，张汝民

（1. 浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 杭州 311300；2. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023）

植物挥发性有机化合物(VOCs)是植物体通过次生代谢途径合成的低沸点、小分子一类化合物[1]，在植物与环境因子、微生物和动物互作中起着重要作用[2]，特别对改善空气质量和提高人类身体健康有积极意义[3]。植物在生长过程中，会产生大量的空气负离子。植物进行光合作用利用二氧化碳(CO2)产生氧气(O2)过程中会形成空气负离子[4]；树叶和树木尖端放电也能产生空气负离子，针叶树比阔叶树更容易产生负离子[5]。空气负离子既能降低PM2.5浓度，也能有效抑制细菌和真菌的生长[6]；同时也是治疗多种慢性疾病的良药[7]，不仅可以缓解人体心血管的舒张压和提高内分泌的稳定性，还能有效降低情绪和血清素含量[8]。FATEMI等[9]在研究植物VOCs对猕猴桃Actinidia chinensis防腐作用时发现：黑香芹Petroselinum crispum和茴香Foeniculum vulgare精油能够完全抑制猕猴桃果实灰霉病Botrytis cinerea的生长；ZHENG等[10]研究发现：反式肉桂醛对水稻Oryza sativa稻曲病病菌Ustilaginoidea virens感染具有较强的抑制作用。受害植物经(E)-2-己烯醛和(Z)-3-乙酸己酯处理后能释放更多的萜烯类化合物[11]；萜烯类物质不仅具有增强植物的抗病能力[12]，还能够抑制真菌生长[13]。同时萜烯类化合物具有重要的药用价值，如紫杉醇具有抗肿瘤效果，青蒿素具有抗疟疾特效[14]。植物释放的挥发物不仅是天然的“防腐剂”“保健品”，也是天然的空气“清洁剂”。林富平等[15]研究金桂Osmanthus fragrans‘Thunbergii’挥发物对空气微生物的作用时发现：金桂对空气中细菌、真菌和放线菌具有较强的抑制作用；谢慧玲等[16]研究发现：皂荚Gleditsia sinensis和五角枫Acer truncatum等8种植物挥发物单体对细菌和放线菌有明显的抑制效果。目前，已有研究者在植物VOCs的抑菌活性[17]和林分空气负离子[18]的研究等方面取得了较大进展。但关于杨梅Myrica rubra、青梅Vatica mangachapoi、茶Camellia sinensis植物VOCs对环境的研究尚未见报道。本研究以杨梅、青梅和茶为对象，测定了3种植物VOCs组分和含量、园内空气负离子和微生物含量，探讨植物VOCs的抑菌和净化空气作用，为选择良好的经济林环境提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样地和供试树种

样地设在杭州市临安区浙江农林大学东湖校区杨梅园、青梅园和茶园(纯园无其他树种)教学实习基地(30°15′25″N，119°43′39″E)，该研究区属中亚热带季风气候，温暖湿润，四季分明，雨热同期，有梅雨季节，空气湿润，年日照时数为1 939.0 h。年均气温为16.4 ℃，1月最低，平均为−0.4～5.5 ℃，极端最低为−13.1 ℃；7月最高，平均为24.4～30.8 ℃，极端最高为41.2 ℃。全年降水量为1 628.6 mm，年平均相对湿度在70%以上。空旷地为园外环境(无树木的影响)；杨梅树高约6.0 m，胸径15.0 cm；青梅树高约5.0 m，胸径10.0 cm；茶树长势均匀，高约0.5 m。无病虫害，树木生长健康。2018年5月选择晴朗无风的天气，气温约30 ℃的条件下开展实验。

1.2 研究方法

1.2.1 VOCs的采集分析 采用QC-2型大气采样仪(北京市劳动保护科学研究所)，在距地面1.5 m(人正常呼吸的平均身高)处，对空旷地(对照)、杨梅、青梅、茶的树木VOCs以及园内空气VOCs进行采集，采集时间为9:00−11:00。气体循环流量为100 mL·min−1，采气时间为1 h，采样重复5次，采集后采摘3种树木叶片称量。3种树木及空气VOCs分析参照GAO等[19]的方法，采用动态顶空气体循环热脱附/气相色谱/质谱联用分析技术(TDS-GC-MS)。通过TDS-GC-MS技术分析，获得VOCs的总离子流量色谱图，利用NIST2008谱库查询，色谱峰面积进行定量分析，并计算相对含量。

1.2.2 空气负离子测定 采用ITC-201A 型(Andes公司生产，日本)空气负离子测定仪，在高度为1.5 m处测定空旷地(对照)、杨梅、青梅和茶园内的空气负离子数。选择5个采样点，采样点的距离为2棵树之间距离取平均值，采样时间为7:00、10:00、13:00、16:00和19:00。

1.2.3 培养基的制备 按照周德庆[20]的方法配制细菌培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)、真菌培养基(马丁式培养基)和放线菌培养基(高式1号培养基)。按照GAO等[19]方法分别配制了体积分数为0.1%、0.5%、1.0% 的罗勒烯、柠檬烯、壬醛和癸醛4种单体的培养基。

1.2.4 微生物采集 采用自然沉降法[16]，在空旷地(对照)、杨梅、青梅和茶园内均设5个采样点，采集微生物。将3种不同培养基的培养皿分别置于离地面1.5 m高的平板支架上，距树干水平距离1.0 m，采集空气中自然漂浮的微生物(细菌、真菌和放线菌)。采样时间为7:00、10:00、13:00、16:00和19:00，培养基在空气中暴露10 min后，用保鲜膜包好后带回实验室置于25 ℃恒温培养箱中培养。接菌的培养皿在25 ℃培养箱培养24 h后进行细菌菌落统计，培养72 h后进行真菌菌落统计，培养96 h后进行放线菌菌落统计。根据微生物计算公式处理微生物数[15]，计算公式为：菌数(个·m−3)=50 000N/(AT)。其中：N为培养皿中菌落平均数(个)；A为培养皿的面积(cm2)；T为打开培养皿皿盖的时间(min)。抑菌率=(对照菌数−处理菌数)/对照菌数×100%。

1.3 数据处理

所有数据均为5次重复的平均值±标准差，利用Origin 9.0进行统计分析和作图。统计方法采用One-Way ANOVA，进行Tukey多重比较(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 3种常绿树VOCs成分分析

3种常绿树VOCs总离子流图共有41种化合物(图1和表1)，主要有萜烯类、酯类、醛类、醇类、酮类和苯类。杨梅检测到22种化合物，其中：萜类有15种，占总量的78.5%，主要有α-草烯、香芹醇、罗勒烯、柠檬烯、石竹烯；4种醇类占总量的19.7%；1种醛类占总量的1.2%。青梅共检测到17种化合物，其中：3种酯类占总量的54.1%，主要有乙酸叶醇酯、丁酸辛酯；萜烯类有5种，占总量的11.1%；4种醛类占总量的12.9%；2种醇类占总量的8.6%。茶检测到26种化合物，其中：5种酯类占总量的40.8%，主要有乙酸叶醇酯、丁酸辛酯、丁酸庚酯；萜类有8种，占总量的17.9%；4种醛类占总量的13.0%；3种醇类占总量的5.2%；2种酮类占总量的5.1%。

比较3种常绿树释放的VOCs成分，杨梅释放VOCs总量最大，其次为茶、青梅。杨梅释放的VOCs主要是α-草烯；青梅和茶释放VOCs均以乙酸叶醇酯为主，但是茶特有的醛类VOCs是庚醛，而青梅特有的醛类是己烯醛。

图1 3种常绿树单株VOCs总离子流图Figure 1 Total ion flow diagrams of three evergreen single plant VOCs

表1 3种常绿树VOCs成分分析Table 1 VOCs components of 3 evergreen plants

2.2 3种常绿树园空气VOCs分析

从图2和表2可以看出：空气中的VOCs总量从高到低分别为青梅园、茶园、杨梅园、空旷地。空气中主要是以苯类为主，也有少量的萜烯类，这些萜烯类化合物在植物中也存在。空旷地检测出12种物质，其中：5种苯类占总量的74.2%，2种萜烯类占总量的10.3%，3种烷烃类占总量的11.9%，2种醛类占总量的3.6%。杨梅园空气中VOCs共检测出10种物质，4种苯类占总量的54.8%，3种萜烯类占总量的35.6%。青梅园空气中VOCs共检测出9种物质，3种苯类占总量的35.4%，4种萜烯类占总量的52.2%，1种醛类占总量的3.1%。茶园空气中检测出13种化合物，包括4种苯类占总量的50.1%，5种萜烯类占总量的36.5%。

比较3种常绿树园和空旷地空气的VOCs发现：青梅园VOCs总量最高，其次为茶园、杨梅园。杨梅园、青梅园和茶园萜烯类化合物均高于35%。从萜烯类化合物总量从高到低依次为青梅园、茶园、杨梅园，苯类化合物总量从高到低依次为空旷地、杨梅园、茶园、青梅园。

图2 3种常绿树园空气VOCs总离子流图Figure 2 Total ion flow charts of air VOCs in 3 evergreen plants gardens

表2 3种常绿树园空气VOCs成分分析Table 2 Air VOCs composition in three evergreen plants gardens

2.3 3种常绿树园空气负离子的比较

由图3可知：空气负离子数在13:00最低，在7:00和19:00最高。杨梅、青梅、茶园内、空旷地日平均值分别为 2 559.2、2 660.0、1 878.4、1 078.8个·cm−3。杨梅园中在 7:00空气负离子数最高，13:00比7:00减少了63.9%，19:00比13:00增加了44.0%；青梅园中的负离子数，13:00比7:00减少了47.8%，19:00比7:00减少了21.4%；茶园中的负离子数7:00比13:00多51.6%，比19:00多19.9%。

2.4 空气微生物分析

从图4A可以看出：空旷地细菌数量明显高于杨梅园、青梅园和茶园。杨梅园、青梅园和茶园均在13:00降幅最大，分别比空旷地降低了53.1%、55.5%和46.9%。茶园细菌数量高于杨梅园和青梅园。在7:00、10:00、13:00、16:00、19:00，茶园细菌数量比空旷地明显下降，分别下降了27.3%、41.3%、46.9%、43.8%和37.4%(P＜0.01)，表明不同园子内随着时间的变化，细菌数量明显不同。从图4B可以看出：杨梅园、青梅园和茶园真菌的数量低于空旷地。各园真菌数量在13:00降幅最大，杨梅园、青梅园和茶园比空旷地分别降低了46.2%、41.7%、38.6%。13:00−19:00空气中的微生物数量明显高于7:00−13:00。从图4C可以看出：空旷地放线菌数量高于杨梅园、青梅园和茶园。杨梅园在13:00抑制率最大，青梅园在10:00降幅最大，茶园在16:00降幅最大，分别降低了50.0%、51.7%、48.5%。各园放线菌降幅程度在16:00−19:00 明显高于 7:00−13:00。

图3 3种常绿树园空气负离子日变化Figure 3 Diurnal variations of negative air ions in 3 evergreen plants

2.5 单体对空气微生物的影响

在单体体积分数为0.1%～0.5%的水平下，罗勒烯抑制细菌的生长效果比柠檬烯明显，在体积百分比为1.0%的水平下，罗勒烯抑制真菌生长的效果比柠檬烯更有效，而柠檬烯抑制放线菌的作用比罗勒烯更强(图5)。2种单体醛对空气微生物具有明显的抑制作用，体积分数为1.0%的壬醛对细菌、真菌和放线菌的抑制率分别为33.1%、43.4%和54.5%；体积分数为1.0%的癸醛对细菌、真菌和放线菌的抑制率分别为48.6%、37.4%和56.1%。在4种单体中，醛类比萜烯类抑制速率更大，醛对细菌、真菌和放线菌生长有明显的抑制作用。

图4 3种常绿树园微生物变化Figure 4 Variation of microbial content in three evergreen plants gardens

3 讨论

植物基因型是决定VOCs种类和含量的重要因素，植物种属间的差异导致释放出的VOCs物质种类与比例具有明显的差异[21]。吴章文等[22]研究发现：8种柏科Cupressaceae(崖柏Thuja sutchuenensis、日本扁柏Chamaecyparis obtusa、干香柏Cupressus duclouxiana、柏木Cupressus funebris、西藏柏木Cupressus torulosa、侧柏Platycladus orientalis、圆柏Sabina chinensis、叉子圆柏Sabina vulgaris)植物释放的VOCs以萜烯类物质为主；迷迭香Rosmarinus officinalis[23]和雪松Cedrus deodara[24]释放的VOCs虽然都是萜烯类物质，但是种类和含量各不相同。本研究显示：茶叶片VOCs是以乙酸叶醇酯为主，与乔如颖等[25]的研究一致，因为白茶叶片富有茸毛，而茸毛是储存、合成VOCs的场所，叶表面附着大量的己烯醛和己烯醇，它们都是合成乙酸叶醇酯的前体，所以乙酸叶醇酯最高。MIYAZAWA等[26]研究发现：青梅果实在未成熟时以醛类物质为主，而成熟期时以酯类物质为主，这与本研究结果相同。杨梅叶片VOCs以萜烯类物质为主，主要是α-草烯，与尹洁等[27]发现杨梅叶中的VOCs主要是α-葎草烯的研究结果一致。

图5 4种单体对空气微生物的影响Figure 5 Effect of 4 monomer concentrations on the micro-organisms

植物能够产生大量的空气负离子是由于存在植物叶片“尖端放电”[28]和“光电效应”[9]的现象。白保勋等[29]研究发现：年均空气负离子数量从高到低依次为森林、果园、农田、绿地；王洪俊[30]发现：乔灌草复层结构、灌草结构、草坪空气负离子数量依次递减。本研究表明：杨梅园、茶园和青梅园的空气负离子日平均数量明显高于空旷地。植物VOCs能够促进空气电离，有助于形成空气负离子，从而增加空气负离子的数量，萜烯类化合物有重要促进作用。3种树园中的空气负离子数量日变化呈早晚较高，中午低的趋势，可能原因是早晚湿度大、温度低影响了空气负离子数量，中午温度和光照强度逐渐增高，植物为了减少蒸腾作用，关闭气孔，植物VOCs释放的速率下降，从而空气负离子数量减少。

植物释放的VOCs具有重要的生态学功能，参与植物直接与间接防御反应，同时防止病菌及微生物的感染。SALEM等[31]和BEHBAHANI等[32]分别研究发现：桉树Eucalyptus robusta油和橄榄Canarium album精油对细菌具有较强的抑菌作用。GAO等[19]研究发现：醛类物质也具有抑菌作用。本研究显示：杨梅园、青梅园和茶园中都有α-蒎烯、莰烯、柠檬烯和壬醛，且细菌、真菌和放线菌的相对含量明显低于空旷地，说明植物VOCs对微生物的生长有抑制作用。同时采用植物VOCs较高的罗勒烯、柠檬烯、壬醛和癸醛对空气微生物的抑制作用发现：随着单体体积分数的增加，抑制效果也逐渐增强，在高体积分数时抑菌效果最明显；醛类物质抑制细菌、真菌和放线菌的效果比萜烯类更明显。杨梅园、青梅园、茶园的空气微生物相对含量低于空旷地，说明罗勒烯、柠檬烯、壬醛和癸醛在植物中可能是抑菌的主要物质[19,33]。

植物VOCs和空气负离子是森林康养的重要组成部分，森林康养是依托植物释放对人有益的VOCs和杀菌素，能够增加空气负离子[34]和提高人的免疫力[35]，是改善人类身心健康的一种疗养方式[36]。同时能够降低促炎细胞因子和应激激素的水平[36]，无论是生理上还是心理上都能得到放松[37]。空气负离子能够调节人的内循环系统，对气管炎、冠心病、脑血管等疾病具有一定的疗效[38]。杨梅园中存在对人有益的VOCs，如α-草烯、罗勒烯、柠檬烯、花柏烯和石竹烯；茶园存在对人有益的VOCs有α-派烯、罗勒烯、柠檬烯，还有抑制微生物生长的庚醛、苯甲醛、辛醛、壬醛；青梅园中有对人有益的VOCs有α-柏木烯、罗勒烯、柠檬烯，也存在壬醛、癸醛和辛醛。总的来说，3种常绿树园在早晚时空气负离子达到最高状态，微生物的抑制效果亦是最强的。

综上所述，杨梅释放的VOCs主要以萜烯类为主，青梅和茶均以酯类为主；3种常绿树园都能释放出对人体有益的VOCs组分，它能够抑制空气微生物的生长，同时具有促进空气负离子形成和改善空气质量的作用。青梅园内的空气负离子比其他园林高，3种常绿树园内的空气质量在7:00和19:00较好，中午最差；园内微生物中细菌相对含量最高，真菌次之，放线菌最少。茶园的微生物(细菌、真菌、放线菌)相对含量居首位，从7:00−19:00呈逐渐增加的趋势。细菌抑制率最高的是青梅园，真菌和放线菌抑制率最高的是杨梅园。