不同类型肺结核患者血浆miR-155和SOCS1表达及临床意义*

吕芳，王松岩，张丽英，尚少红，罗燕青，曾宪升，唐丹丹**

(1.石景山医院 急诊科，北京 100043；2.石景山医院 呼吸科，北京 100043；3.湖北文理学院附属医院，襄阳市中心医院呼吸内科，湖北 襄阳 441021)

结核病(tuberculosis，TB)是由结核分歧杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的一种慢性传染性疾病，严重威胁人类的身心健康，关于肺结核的研究治疗已经引起了医学界的高度重视[1]。微小RNA (microRNAs，miRNA)广泛存在于真核细胞中，是高度保守的非编码单链小RNA分子，与肿瘤、免疫性疾病及感染性疾病等多种疾病的发生、发展密切相关[2]。微小RNA-155 (microRNAs-155，miR-155)是miRNA的重要成员之一，可参与炎症反应、免疫应答、病毒感染及造血等多种生理病理过程，有研究发现miR-155可能与肺部疾病的发生、发展关系密切[3]。细胞因子信号转导抑制物1(suppressor of cytokine singaling 1，SOCS1)是SOCS家族的一员，是由细胞产生的一类可阻断多种细胞因子信号转导过程的负性调节因子，可通过抑制JAK/STAT、酪氨酸激酶受体信号转导通路来阻断相关因子所介导的信号转导，可能参与多种免疫反应调控，在控制免疫细胞分化中起着重要的作用[4-5]。目前关于miR-155与SOCS1在肺结核中作用的研究较少，本研究通过检测不同时期肺结核患者血浆中miR-155和SOCS1的表达水平，分析二者与肺结核发病的关系，报告如下。

1 资料与方法

1.1对象及主要试剂与仪器

1.1.1研究对象 选取2017年10月—2018年10月收治的90例TB患者作为研究对象。纳入标准：(1)符合“中华人民共和国卫生行业标准法定传染病诊断标准(WS288-2017)”中肺结核诊断标准、并且确诊为肺结核患者，(2)均接受抗结核治疗，(3)年龄为20～80岁，(4)同意加入本研究。排除标准：(1)合并糖尿病、高血压及自身免疫病等慢性疾病者，(2)合并心血管、肾脏、肝脏等器质性疾病者，(3)合并HIV、HBV等人类免疫缺陷病毒感染疾病者，(4)近期使用免疫抑制剂类药物或糖皮质激素类药物治疗的患者，(5)结核病治疗产生耐药者。30例活动性肺结核患者作为活动性结核组、30例完成结核治疗患者作为治疗完成组，30例结核潜伏感染者为潜伏感染组，另选取同期健康体检者40例作为对照组。本研究经本院道德伦理委员会批准通过，均取得入选者或家属知情同意并签字，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》的规定。

1.1.2主要试剂与仪器 miRcute miRNA提取分离试剂盒(货号DP501)，购自北京天根生化有限公司；miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(货号KR201)，购自北京天根生化有限公司；荧光定量检测试剂盒(货号FP401)，购自北京天根生化有限公司；SOCS1因子ELISA试剂盒(货号ml023953)，购自上海酶联科技生物有限公司；上下游引物，均购自大连TaKaRa公司；无水乙醇、PBS等均购自上海生物工程有限公司。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪(型号7500Fat)，购自美国AB公司；一般PCR仪(型号TC3000)，购自英国Techne公司；紫外分光光度计(型号NanoDrop2000)，购自美国Merin-ton公司；酶标仪(型号MODEL550)，购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1样品的收集及处理 活动性结核组、潜伏感染组于入院时，治疗完成组于治疗结束时，对照组于体检当日采集早晨空腹外周静脉血5 mL，加入肝素钠抗凝后以2 000 r/min离心 15 min，在30 min内使用miRcute miRNA提取分离试剂盒提取细胞miRNA，并检测其浓度与纯度，保存于-80 ℃备用。使用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒进行逆转录反应，操作步骤严格按照说明书使用，反应体系为500 g/L总RNA 1 μL，2×反转录缓冲混合物10 μL，RNase Free 水5 μL，反转录酶2 μL，0.1% BSA 2 μL，总体积 20 μL。反应条件为：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。合成的cDNA保存于-20 ℃备用。

1.2.2血浆中miR-155水平检测 采用RT-qPCR法检测，引物序列见表1，反应体系为2×miRcute miRNA Premix 10 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL，正向引物0.4 μL，正向引物0.4 μL，总体积20 μL。参PCR反应条件为94 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s、60 ℃ 34 s，45个循环。溶解曲线分析条件为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s (收集荧光信号)，60 ℃ 15 min。每个样品重复3次。使用U6为内参基因，以U6的拷贝数作为校正基数，获得各样本的Ct值，通过Ct值计算miR-155表达水平，相对表达水平RQ=2-ΔΔCt(ΔCt = Ct目标-Ct内参，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组)。

1.2.3血浆中SOCS1水平检测 采用ELISA法检测，试剂盒为SOCS1 ELISA试剂盒，检测步骤严格按试剂盒说明书进行操作。

表1 miR-155及U6引物序列Tab.1 Primer sequences of miR-155 and U6

1.3统计学分析

2 结果

2.1一般资料

4组研究对象的年龄、性别、体质量指数(BMI)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 4组研究对象一般资料比较Tab.2 Comparison of general information in four groups

2.2血浆miR-155及SOCS1水平

结果显示，对照组、治疗完成组、潜伏感染组、活动性结核组血浆miR-155水平逐渐升高，SOCS1水平逐渐降低，两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4组研究对象血浆miR-155和SOCS1水平比较Tab.3 Comparison of plasma miR-155 and SOCS1 levels in four

2.3ROC评价血浆miR-155、SOCS1对肺结核的诊断价值

ROC曲线分析显示，血浆miR-155、SOCS1诊断肺结核的AUC为0.938、0.808，当miR-155水平>1.86、SOCS1水平<192.89 μg/L时，患肺结核的几率较高，对应的灵敏度分别为83.33%、93.335，特异度分别为92.56%、65.00%。见图1、表4。

图1 血浆miR-155和SOCS1诊断肺结核的ROC曲线Fig.1 ROC curves of plasma miR-155 and SOCS-1 in the diagnosis of pulmonary TB

表4 血浆miR-155、SOCS1对肺结核的诊断价值Tab.4 The diagnostic values of plasma miR-155 and SOCS1 in pulmonary TB

2.4肺结核患者血浆miR-155、SOCS1水平的相关性

Pearson结果显示，肺结核患者血浆miR-155、SOCS1水平呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.455，P<0.05)。见图2。

图2 肺结核患者血浆miR-155和SOCS1水平的相关性Fig.2 Person correlation plot of plasma miR-155 and SOCS1 levels in pulmonary TB

3 讨论

肺结核是临床常见的慢性传染病，人群均容易受到感染，表现为低热、盗汗、咳嗽、咯血及消瘦等症状，组织病理特点多为结核结节、空洞形成及干酪样坏死[6]。有研究表明肺结核患者在发病后可以通过T淋巴细胞分泌干扰素、肿瘤坏死因子及白细胞介素(IL)等细胞因子，参与免疫调节从而控制MTB[7-8]。

MicroRNA是一种小RNA分子，能够在血清中稳定存在，不会被RNA内切酶降解，在强酸、强碱、高温煮沸、反复冻融等条件下也不容易降解[9-10]。有研究表明，miRNA在肿瘤、心血管疾病以及肺结核、肺纤维化、哮喘等呼吸系统疾病的发生、发展中起着重要的作用[6,11]，通过转录后机制调控靶基因的翻译或表达[12-13]。miR-155是miRNA的重要成员之一，由B细胞集成簇(B cell integration cluster，BIC)基因活化而成，miR-155的免疫功能与其对SOCSl的调节有重要关联[14]。SOCSl作为miR-155的重要靶基因之一，可负调控JAK/STAT通路，从而参与肺癌、肺结核及肿瘤的发生与发展[15]。miR-155最早被看做一个致癌基因，在肺癌、肺结核、胃癌、淋巴瘤、胰腺癌及白血病患者中表达水平显著升高[16-18]，与肿瘤、癌症等恶性疾病的发生、发展密切相关。本研究发现结核治疗完成组、结核潜伏感染组、活动性结核组患者血浆中miR-155水平逐渐升高，均高于对照组，表明miR-155在肺结核患者血浆中呈现高表达，与陈雪芳、曹帅丽等[19-20]的研究结果一致，提示miR-155可能与肺结核的发生、发展有关。但这部分的结果已有相似的研究，未能形成亮点，因此本研究进一步分析发现，血浆miR-155水平对肺结核诊断价值的AUC为0.938，截断值为1.706，其灵敏度、特异度分别为83.33%、92.56%，提示血浆miR-155对于预测肺结核有较高的诊断价值。

SOCS1是SOCS家族的一员，突变、甲基化等可导致SOCS1表达量减少，在肿瘤等恶性疾病发生、发展中有重要作用[21-22]。有研究表明，SOCS1可抑制不同信号转导途径，具有潜在的增值效应，靶向SOCS1的基因治疗对肺癌有很较好的效果[23]。包志瑶等[24]的研究发现，特发性肺纤维化(IPF)患者外周血中SOCS1 mRNA表达水平明显低于对照组，与胸部高分辨CT(HRCT)及血清IL-4水平呈负相关，提示SOCS1可能与IPF的发生、发展有密切关系，可作为IPF疾病严重程度的指标。杨绍俊等[25]的研究也发现TLR2、SOCS1及miR-155在各组别中存在差异表达，SOCS1在活动型结核组中表达水平明显高于正常组及潜伏型结核组，miR-155/SOCS1比值在活动型结核组中明显低于正常组及潜伏型结核组，提示TLR2、SOCS1及miR-155在人外周血单个核细胞中的差异表达及miR-155/SOCS1比值对肺结核的诊断有一定的参考价值。本研究结果显示结核治疗完成组、潜伏感染组、活动性结核组患者血浆SOCS1水平依次降低，均低于正常对照组，表明SOCS1在肺结核患者血浆中呈现低表达，该结果与杨绍俊等[25]的研究结果不符，可能与患者个人差异或样本量少等有关。进一步研究发现，血浆SOCS1水平对肺结核诊断的AUC为0.808，截断值为192.896，其灵敏度、特异度分别为93.33%、65.00%，提示血浆SOCS1水平与肺结核的发生密切相关，对肺结核具有一定的诊断价值。另外，本研究还发现，miR-155、SOCS1在患者血浆中呈现负相关关系，提示二者可能共同参与调节肺结核的发生、发展。

综上所述，miR-155在肺结核患者血浆中呈现高表达，SOCS1在肺结核患者血浆中呈现低表达，二者呈负相关关系，对肺结核均有较高的诊断价值。但是由于样本数量不多，尚有不足之处，今后将进一步扩大样本数量进行研究。