BRAFV600E基因突变与甲状腺乳头状癌临床病理特征的相关性*

胡斌，冯江龙，沈丹丹，邓超男**，文静

(1.贵州医科大学附属医院 病理科，贵州 贵阳 550001；2.贵州医科大学附属医院 超声中心，贵州 贵阳 550001)

甲状腺癌被认为是最常见的内分泌恶性肿瘤，近年来发病率呈现逐年上升的趋势[1]。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer，PTC)是其最常见的病理类型，约占甲状腺癌的80%～90%[2]。虽然大部分PTC患者恶性程度不高、预后良好，但仍有近10%患者出现了复发、转移，表现出极强的侵袭性[3]，因此，甲状腺乳头状癌的早期确诊和充分的预后评估显得尤为重要。有文献报道BRAFV600E基因突变在甲状腺恶性肿瘤中多见于PTC，极少见于其他类型恶性肿瘤[4]。BRAFV600E基因突变和PTC的发生、发展及预后相关，是其发生的重要遗传学改变[5]，但关于BRAFV600E基因突变与PTC各临床病理特征的相关性仍存在争论。因此，本研究采用实时荧光定量PCR法对325例PTC患者和50例甲状腺良性病变患者进行BRAFV600E基因检测，通过对比分析PTC患者的临床病理特征是否与BRAFV600E基因突变存在关联性，探讨BRAFV600E基因突变可否作为PTC发生、发展及预后的评判指标，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源 选取2019年6—9月病理诊断为PTC的患者325例作为PTC组，同时选取同期病理诊断为甲状腺良性病变的患者50例作为对照组，均排除术前曾行放化疗和/或内分泌治疗、有其他恶性肿瘤、有远处转移、未行中央区淋巴结清扫及临床资料缺失者。PTC组患者男性119例、女性206例，年龄16～58岁、中位年龄45岁、≤45岁和>45岁各为177例和148例，肿瘤直径≤1 cm者279例、>1 cm者46例，单病灶者241例、多病灶者84例，经典型306例、滤泡亚型19例，有淋巴结转移106例、无淋巴结转移219例，被膜外侵犯27例、被膜外未侵犯298例，临床Ⅰ～Ⅱ期318例、Ⅲ～Ⅳ期7例，伴有桥本氏甲状腺炎105例、未伴桥本氏甲状腺炎220例。对照组男性18例、女性32例，年龄19～52岁、中位年龄45岁、≤45岁和>45岁各为23例和27例，甲状腺腺瘤17例、亚急性甲状腺炎12例及结节性甲状腺肿21例。取2组患者的病灶石蜡切片作为标本，切片均经常规石蜡切片HE染色，且由2名副高以上病理医师确认诊断。

1.1.2主要试剂和仪器 FFPE DNA石蜡切片样品DNA提取试剂盒(批号12220021401x)和人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒(批号11219120301z)均购自中国厦门艾德生物医药科技股份有限公司，二甲苯购自中国重庆江川化工有限公司，乙醇购自中国重庆正元化工有限公司，宏石SLAN-965荧光定量PCR仪购自中国厦门宏石有限公司，OD-2000TM超微量分光光度计购自美国Thermo Scientific公司。

1.2方法

1.2.1石蜡组织DNA提取 用相应的石蜡块切片，制成8 μm厚的切片5张，经二甲苯脱蜡、乙醇漂洗后，显微镜观察筛选出肿瘤组织丰富的区域刮取适量组织，并根据DNA提取试剂盒说明书的操作步骤进行DNA提取。

1.2.2基因突变检测及判断 抽取DNA后采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)直接测序法来检测BRAF基因第15号外显子，以判断其是否发生突变。操作方法：将DNA原液以5 mg/L浓度稀释，按每管DNA稀释液 ∶Taq酶为13.5 μL ∶1.5 μL 的比例，以3 μL/孔加入装有检测混合液的8联管中，采用荧光定量PCR检测仪按照试剂盒说明书进行PCR扩增：95 ℃预变性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸60 s(采集荧光)，40个循环，得到相应Ct值。同时满足以下3点可认为扩增成功[6]：(1)待测样本和阳性质控的内控信号升起;(2)阴性对照内控信号和外控信号均无升起;(3)阳性质控的外控信号Ct值<20。BRAFV600E突变结果判断：(1)待测样本外控信号的Ct值≥28，为BRAFV600E未突变；(2)待测样本Ct值<28则认为BRAFV600E突变。

1.3统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，甲状腺良性病变与PTC间BRAFV600E基因突变率比较及BRAFV600E基因突变与PTC患者临床病理特征的相关性分析采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1BRAFV600E基因突变率

对照组患者标本中的50例甲状腺良性病变均未发生BRAFV600E基因突变，PTC组患者中有248例发生BRAFV600E基因突变(图1)；PTC组患者BRAFV600E基因突变率(76.3%)明显高于对照组(0.0%)，差异有高度统计学意义(P<0.001，表1)。

注：样本扩增曲线未升起(无扩增信号)，说明该样本在该位点上未发生突变，检测结果为野生型；反之，样本扩增曲线升起(有扩增信号)，说明该样本在该位点上发生突变，检测结果为突变型。图1 2组患者BRAFV600E基因突变结果Fig.1 BRAFV600E gene mutation results between two groups

表1 2组患者的BRAFV600E基因突变率比较Tab.1 Comparison of BRAFV600E gene mutation rates between two groups

2.2BRAFV600E基因与临床病理特征相关性

PTC组患者BRAFV600E基因突变与其年龄、性别、肿瘤病灶数、肿块大小、组织学亚型及临床分期比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示BRAFV600E突变与PTC患者预后无关；但与甲状腺被膜外侵犯、淋巴结转移及伴有桥本氏甲状腺炎的差异均有统计学意义(P<0.05)，提示BRAFV600E突变与PTC患者预后有关。见表2。

表2 BRAFV600E基因突变与PTC患者临床病理特征的相关性[n(%)]Tab.2 Correlation between BRAFV600E gene mutation and clinicopathological features of PTC patients [n(%)]

3 讨论

BRAF基因是RAF蛋白酶家族中的重要成员[7]。BRAFV600E基因突变已经被认为是PTC的重要分子标记物[8]，但不同国家研究中，BRAFV600E基因在PTC中的突变率不同，范围为29%～90%[9-11]。而BRAFV600E在甲状腺良性病变中突变率为0%，因此被认为其具有非常高的特异性[12]。本研究发现在PTC患者中突变率76.3%，良性病变为0%，与既往研究结果一致。由此可见，BRAFV600E基因突变可作为辅助诊断PTC的指标，对甲状腺结节恶性肿瘤有较高的阳性预测价值[13]。

目前关于BRAFV600E与PTC患者的年龄、性别、肿瘤大小及数目的相关性存在颇多争议，如Huang等[14]Meta-analysis分析发现BRAFV600E基因突变与患者的年龄和性别无关；有报道指出[15]，BRAFV600E基因突变仅与患者的年龄有显著相关性；秦东广等[16]研究发现BRAFV600E突变与肿瘤直径大小(≥1cm与<1cm)有相关性；洪玉蓉等[17]研究则认为BRAFV600E基因突变与淋巴结转移、甲状腺包膜外侵犯、肿瘤大小及数目均无相关性，证明BRAFV600E基因突变与患者的年龄、性别、淋巴结转移、甲状腺包膜外侵犯、肿瘤大小及数目的关联性存在不确定性。本研究结果表明，BRAFV600E基因突变与患者的年龄、性别、肿瘤大小及数目均无相关性(P>0.05)，说明BRAFV600E基因突变可能与患者的年龄、性别、肿瘤大小及数目无关。

甲状腺癌的不同亚型不仅表现为不同的突变率，而且有不同的侵袭性。赵跃等[18]研究证实了此论点。本研究中由于研究对象有限，未能观察到高细胞亚型、柱状细胞亚型和弥漫硬化亚型这些较为少见的亚型，仅发现BRAFV600E基因突变在PTC患者经典亚型和滤泡亚型中未表现出差异(P>0.05)。证明在PTC的各种亚型中经典亚型和滤泡亚型具有相近的侵袭性。

有研究发现，BRAFV600E突变与PTC患者年龄、甲状腺腺外侵犯、肿瘤组织大小及其分期显著相关，认为甲状腺外侵犯、高临床分期及淋巴结转移是PTC重要的预后不良因素[19-20]，但也有文献报道，BRAFV600E突变和TNM临床分期无关联[21-22]。本研究中BRAFV600E突变与甲状腺临床分期差异无统计学意义(P>0.05)，而与甲状腺被膜侵犯及淋巴结转移有关(P<0.05)。325名PTC组患者中Ⅰ～Ⅱ期患者318名(97.8%)，Ⅲ～Ⅳ期患者仅7人，这可能与人们健康保护意识的增强及诊疗条件不断完善密切相关，同时也提示对疾病早发现、早治疗可减少Ⅲ～Ⅳ期患者的发病率。本研究中甲状腺被膜外侵犯组的BRAFV600E阳性率(96.3%)，高于无被膜外侵犯组BRAFV600E阳性率(74.5%，P<0.05)，这与大部分的文献报道一致。有观点认为BRAFV600E突变与PTC患者的淋巴结转移具有相关性[23-25]，但也有人认为BRAFV600E突变与淋巴结转移无明显相关性[26-27]。本研究PTC患者中淋巴结发生转移者的BRAFV600E突变率高于未发生转移者(P<0.05)，因此推测伴有BRAFV600E基因突变的PTC患者更易发生淋巴结转移，提示临床可对这部分患者应采取更为积极的治疗方案以减少复发风险。

桥本氏甲状腺炎是一种慢性炎症，可下调BRAFV600E突变率，降低颈中央区淋巴结的转移率，使肿瘤的侵袭性下降，对甲状腺乳头状癌的发生、发展有着重要的影响[28]。有研究认为伴有桥本氏甲状腺炎的患者BRAFV600E突变率相对较低，提示桥本氏甲状腺炎可能是PTC患者的一个潜在保护因素[29]。本研究中未伴桥本氏甲状腺炎的PTC患者BRAFV600E突变率(88.0%)高于伴桥本氏甲状腺炎者(52.0%，P<0.05)，结论支持上述文献报道。

综上所述，BRAFV600E基因突变在不同甲状腺疾病患者中表现各异，尤其是与PTC的淋巴结转移、甲状腺外膜侵犯及伴发桥本氏甲状腺炎等密切相关，提示其有望成为评估PTC诊断、治疗及预后的指标，但本研究为单中心回顾性研究，还需扩大样本量，进一步探讨及验证BRAFV600E与PTC的临床病理特征相关性及机制。