“Ca2+转化法”实验方法补充及基因工程专题的教学建议

胡鹏伟

摘 要：文章以高中生物选修三中“将目的基因导入微生物细胞”实验方法为例，理清导入方法的不明之处，优化对该步骤的语言表述，并对基因工程板块内容的教学提出建议，使得该部分内容易于被学生理解，促进核心素养的培养。

关键词：目的基因;导入;基因工程;核心素养

中图分类号：G633.91 文献标识码：A 收稿日期：2019-11-17 文章编号：1674-120X（2020）16-0079-02

高中生物是一门以科学实验为基础的技术课程，兼具多种教育功能（如基本科学素养、审美育人功能）。《普通高中生物课程标准（2017年版）》也明确了生物学科素养的重要性。实验与理论相结合的生物教学能实现教育部现正大力提倡的核心素养目标。“3+1+2”高考新模式在部分省市已然推行，生物选修模块内容分量也在变重，选修三中基因工程常年考查，数据显示：近六年基因工程考查分值（51分）在高中生物选修三总体考查中（75分）占到68%。

另外，2017年开始修订的《考试说明》中对“基因工程的基本原理及技术”内容做出了明确要求，并在修订的《考试大纲》中明确加入“PCR技术”的内容，可见选修三部分内容的重要性得到了回应，且基因工程也属生物学前沿知识，在以后的生物信息化教学、信息化发展中也会起到引领作用，其内容重要性不容忽视。

一、“将目的基因导入微生物细胞”实验方法补充

本部分（高中生物必修三教材第12页）明确介绍了几种常用的导入方法：导入植物细胞的农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法;导入动物细胞的显微注射技术。在导入微生物细胞这方面，教材介绍得不明确。

（一）大肠杆菌转化的具体方法

关于导入方法，现以2016年浙江模拟题（节选）为例，某课题组进行了下图的实验，请回答：图中导入重组质粒的方法是___，在导入之前应用一定浓度的___处理受体细菌。（答案：Ca2+转化法  CaCl2溶液）

教材中叙述模糊的问题在对比下就显现出来：Ca2+转化法在教材中并未言明，且Ca2+处理法是用于制备大肠杆菌感受态细胞，之后才导入。在一些文献中，农杆菌感受态细胞也是在Ca2+溶液的处理下得到的，接着可以用来导入外源DNA，以Ca2+转化法命名稍显笼统，不像导入动植物细胞的方法那样具体。笔者查阅大量资料，现总结如下：

1.电击法转化大肠杆菌

此方法不需要预先诱导细菌的感受态，原理为：依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌。

细菌经培养生长至对数中期，冷却、离心后用预冷过的蒸馏水或者缓冲液充分洗净以降低细胞悬液的离子强度，而后再用含10%甘油的缓冲液悬浮。当细菌受到短时高压电击时，DNA可立即被导入感受态细胞。

2.42度热激法转化大肠杆菌

与教材中转化第二步的叙述最接近的便是42度热激法，也是目前实验室转化大肠杆菌的主流方法。其原理为：在0℃条件下，用低渗溶液氯化钙去处理细菌，菌体细胞在条件变化时会改变形态膨胀成球形，DNA与CaCl2形成羟基-钙磷酸复合物，黏附于细胞表面（感受态细胞很容易与DNA黏附在一起）。经短时间42度热激处理，促使细胞吸收DNA复合物，完成导入。

（二）将目的基因导入其他微生物细胞的具体方法

例题：（2012上海高考卷节选）下图是将人的生长激素基因导入细菌D细胞内，产生“工程菌”的示意图。所用的运载体为质粒A，生长素合成基因为B，请回答：图中A和B产生的C叫__，除细菌外，理论上能够接纳C的受体细胞还可以是___。（答案：重组质粒  酵母菌）

答案表明真菌类也能作为接纳C的受体细胞，教材无此内容，在教学实践中需要补充来适应推陈出新的试题类型，拓宽学生在生物科技专题的知识面。

1.PEG/LiAC（聚乙二醇/醋酸锂）介导的42度热激法转化酵母菌

目前导入酵母菌的主流方法为PEG/LiAC（聚乙二醇/醋酸锂）介导的42度热激法。其原理为：用醋酸锂法制备酵母感受态细胞，增大酵母细胞对外孔隙，然后与重组表达载体在42度水浴加热下混合共存15min，在PEG/LiAC的帮助下，促进酵母感受态细胞吸收DNA分子。

2.液氮冻融法转化农杆菌

农杆菌感受态细胞制备方法类似大肠杆菌，用CaCl2法来制备;导入法为液氮冻融法。其原理为：载体DNA分子溶于缓冲液与感受态细胞混合，液氮60s速冻处理，促使细胞吸收DNA复合物。完成导入的农杆菌用于“目的基因导入植物细胞——农杆菌转化法”当中。

二、对基因工程板块内容的教学建议

（一）对“将目的基因导入微生物细胞”方法的补充更新

结合以上论证，反观教材的叙述内容，可做如下补充：

1.微生物受体细胞种类

常用的有大肠杆菌、农杆菌[2]和酵母菌，受体细胞准备环节是化学法制备感受态细胞。制备方法为：大肠杆菌和农杆菌为Ca2+处理法，酵母菌为醋酸锂处理法。

2.明确导入方法

导入大肠杆菌常用42度热激法，导入农杆菌为液氮冻融法，导入酵母菌为PEG/LiAC介导的42度热激法。

（二）重视基因工程板块知识点更新，以事实为主，体现科学精神

基因工程内容属前沿知识，变化较快。《中国学生发展核心素养》指出：“要体现科学精神，崇尚真知并具理性思维。”实事求是，探究求真精神必不可少。本板块重点是学习科技知识和新成果，掌握原理方法，体现核心素养之科學精神。

授课时要指明框架，注重知识更新但不脱离学生实际基础，拓宽知识面。比如，点明大肠杆菌、农杆菌和酵母菌的导入方法和受体细胞的处理方法;对具体环节原理不加深入，对已明确发展的事实不做模糊化处理。当然，也要照顾到基础知识的全面性和系统性，且不超纲。

（三）重视基因工程课标考查点，前后实验知识联结，助力学生学会学习

教学中要注重前后实验知识和经验的联结。例如，必修一中用显微镜观察多种多样的细胞，真菌和细菌细胞结构不同，故导入方法各异;探究酵母菌的呼吸方式和酵母菌数量的动态变化，学生对真菌的生存状态有一定的了解，在选修部分介绍酵母菌的导入，学生不会陌生;特别是学生已经有了选修一微生物实验的无菌操作以及大肠杆菌的培养等实验知识基础，授课时将酵母菌、农杆菌和大肠杆菌的导入知识具体化，也利于深化学生对真菌、细菌等微生物细胞知识的理解。

《中国学生发展核心素养》指出，学生要学会学习，在学习方法和进程等方面要有选择和调控，勤于反思。本板块知识联结前置实验知识，促成学生学习策略的形成，学会学习。

（四）重视生活与基因工程知识的联系，培养学生处理信息的能力，体现国家认同与社会责任

中国学生发展核心素养包含国家认同与社会责任，即引导学生认同国民身份和国家现有科技成就。社会责任层面又包含生态意识和责任担当，即使学生形成可持续发展理念，对未来有责任意识。

生活中，电视、网络及杂志等媒体都有基因工程新成果的介绍。比如，2016年世界生命科学大会展示的冠鲤，也是转基因并选育获得的;2018年1月在顶级生物杂志Cell上的一篇研究报告展示了中国科学家克隆出了第一批非人灵长类动物——食蟹猴，将这些科技进展信息用于教学，可提升学生国家认同感，增强作为公民的归属感和荣誉感。

基因工程进展同时带来诸多问题，如2012年“黄金大米”事件，2016年崔永元与方舟子有关基因工程安全性的论战;2017中美“百日计划”中引进美国牛肉等，引发学生多角度思考问题、理智处理问题，引导学生思考基因工程发展对生态环境的负效应及出现的其他的安全问题，引导学生对信息进行多面分析，提高学生处理信息的能力，并培养社会责任意识。

（五）重视该板块知识与实验的联系，培养学生动手能力，体现核心素养之实践创新

基因工程内容微观而难以把握，在多数情况下教师以多媒体辅助教学，依然类似“纸上谈兵”，动手实践才能使学生深刻把握，也加强了学生对生物的兴趣和提升学生自身的科学素养。中国学生发展核心素养包含实践创新，主要强调学生在勤于实践、敢于创新方面的具体表现，提高学生批判质疑和问题解决的能力。

随着教学和知识的变化，高中阶段开设分子实验是必然趋势。为帮助学生理解微观知识内容，建议开展导入大肠杆菌这个环节的实验课程，准备连接产物、培养基和无菌试验条件，加之许多学校均有微生物实验的基础，可行性较高，能增强学生对基因工程知识的掌握和动手实践的体验感悟，达到拓展学生的生物科技视野和增强学生科学意识的目的，为其进一步钻研生物类专业奠定良好的基础。[3]

参考文献：

[1]杨江伟，张 宁，唐 勋，等.生物技术专业基因工程课程教学改革与实践[J].陇东学院学报，2019，30（5）：113-117.

[2]王凤欢，冯 滢，马旭策，等.农杆菌介导花生胚小叶遗传转化体系的优化研究[J].河南农业，2019（17）：23-25.

[3]范思宇.高中生物學任务驱动式教学中情境创设的应用研究[D].呼和浩特：内蒙古师范大学，2019.