基于生物膜干涉技术的单克隆抗体高通量定量检测方法的建立

胡 妍， 罗 安， 车耀健， 刘全裕

单克隆抗体因特异性强、疗效显著，其应用正在逐步改变肿瘤治疗局面[1]。通常采用瞬转或者稳转的方式可获得能分泌高效单克隆抗体的细胞株，且在挑选细胞株过程中需要对细胞表达量进行实时监测[2-4]。

生物膜干涉(bio-layer interaction，BLI)技术是基于光干涉信号实现对生物分子快速检测的非标记分析检测技术，其原理为：生物传感器底端由生物膜层覆盖，当生物膜层与另外一种分子接触后，生物膜层厚度增加，接触后，光干涉光谱位移在传感器膜层发生变化，通过监测位移变化，对样品浓度进行定量[5]。与其他蛋白检测方法相比[6-7]，BLI方法具有实时提供分析物信息、分析速度快和样品耗量少等优点[8]。Octet是基于BLI原理发展起来的商业化设备，该仪器还具有能实现无损检测的优势[9]。

抗体可根据结构中是否含有Fc片段进行分类[10-11]，从而选择不同类型的生物传感器进行含量测定。protein A 生物传感器能与单克隆抗体上的Fc段特异性结合[12-13]，采用浸入即读式模式对单克隆抗体进行浓度测定。本研究运用BLI技术，建立单克隆抗体高通量浓度定量方法，并对该检测方法进行方法学研究。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器 分子相互作用分析仪(Octet Red 96，包括自动操作和数据分析软件，美国Pall公司)，手持式pH测量仪(SG 23，梅特勒-托利多仪器公司)，电子分析天平(Practum 124-1CN，德国赛多利斯公司)。

1.1.2试剂 自制的单克隆抗体的工作标准品(纯度为99.6%)、双价单链抗体(diabody)的工作标准品(纯度为99.8%)由本单位提供，protein A生物传感器(批号：1812082，美国Pall公司)，96孔板(批号：E17023P8，美国Greiner bio-one公司)，CD-CHO培养基(批号：2066133，美国Gibco公司)，磷酸盐缓冲溶液(批号：10817010，美国Corning公司)，甘氨酸(批号：SLBN5537Y，美国Sigma公司)，盐酸(批号：20180122，中国国药公司)，吐温-20(MKBS1669V，美国Sigma公司)，实验用水为Milli-pore超纯水。

1.2方法

1.2.1溶液配制 中和液：取100 μL吐温-20溶液加至500 mL PBS缓冲液中，混匀；再生液(10 mmol/L甘氨酸，pH 1.7)：称取75 mg甘氨酸，加水溶解并定容至100 mL，滴加盐酸将溶液pH调至1.7。

1.2.2检测条件 检测温度30 ℃，样品盘转速400 r/min，样品与生物传感器定量结合时间120 s，再生时间5 s，中和时间5 s，样品或溶液量每孔200 μL。

1.2.3检测过程 protein A传感器在再生液中浸泡5 s，中和液中浸泡5 s，中和、再生步骤重复3次，再在样品溶液中浸泡120 s，对样品进行定量检测，最后重复中和、再生步骤3次，用于再生和平衡传感器。

1.2.4方法学验证

1.2.4.1方法的专属性试验 取表达单克隆抗体的培养基、细胞上清和diabody标准品3种样品，加至96孔板中，按照1.2.2的检测条件进行检测。

1.2.4.2回归关系考察 取500 μg/mL的单克隆抗体工作标准品，用平衡液将标准品进行倍比稀释，制得7.81～500 μg/mL共7个浓度的溶液，采用1.2.2检测条件进行分析。

1.2.4.3检测限和定量限 将单克隆抗体的工作标准品不断稀释，采用1.2.2的检测条件分析，以信噪比(s/n)=3时的标准品浓度为检测限，以s/n=10时的标准品浓度为定量限。另配制6份最低定量限浓度的溶液，测定样品浓度并计算相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.4.4准确度和精密度试验 按细胞上清与标准品体积比分别为0.5∶1，1∶1，1.5∶1的比例配制3份样品，每份样品重复3孔，采用1.2.2的检测条件进行定量分析，计算9份样品的回收率。取细胞上清，重复6孔，加至96孔板中，进行定量分析，计算6个样品的精密度。由实验室另外两名实验人员按照溶液配制方法配制溶液并按照检测条件和检测步骤各对6份细胞上清进行定量检测，计算12份样品的中间精密度。

1.2.4.5溶液的稳定性和耐用性试验 进行不同批次样品浓度测定时，每次在96孔板中加入150 μg/mL的标准品溶液作为阳性对照，得出每次阳性对照的实际值，并计算RSD以考察溶液的稳定性。取表达单克隆抗体的细胞上清，按照1.2.2的检测条件测定，记录样品浓度值，再分别记录再生液pH变化±0.2、平衡液吐温-20比例变化±5%、检测温度变化±5 ℃、转盘速度变化±20%时样品浓度值[14]，每个变化条件下重复2孔，总共16次，计算这16次样品浓度的RSD。

1.2.4.6UPLC检测试验 参照文献[15]方法，使用Waters UPLC超高效液相色谱仪、protein A色谱柱；检测条件为：柱温30 ℃、检测波长280 nm；进样体积为10 μL；流动相A(10 mmol/L PBS含0.15 mol/L NaCl, pH 7.2)-流动相B(0.15 mol/L NaCl, pH 2.6)进行梯度洗脱，流速0.5 mL/min，进而对单克隆抗体含量进行检测。

1.2.4.7Octet检测数据与UPLC-protein A检测结果的比较试验 取已培养14 d的细胞上清溶液，分别使用Octet和UPLC检测方法进行定量检测，比较两种定量方法的检测结果。

2 结 果

2.1方法的专属性结果 protein A传感器在表达单克隆抗体的细胞上清中能产生结合信号，在diabody标准品溶液及CD-CHO培养基中不产生结合信号，结果见图1。单链抗体、培养基样品的相对干涉光谱位移变化几乎为0(bingding)，而表达单克隆抗体的细胞上清随着结合时间增加，厚度也随之增加，表明protein A能特异性结合有Fc段的单克隆抗体，结合过程中不受其他类型干扰物质的影响。

2.2拟合结果 随着单抗工作标准品浓度降低，其在protein A传感器表面结合减少，使得传感器末端厚度减小，经计算，结合速率与浓度呈良好的拟合关系，决定系数R2为0.999 9。结果见图2。

2.3检测限和定量限 当s/n=3时，单克隆抗体的检测限为0.6 μg/mL；当s/n=10时，单克隆抗体的检测限为2 μg/mL。6份2 μg/mL的单抗溶液的RSD为2.34%。

2.4准确度和精密度试验结果 根据公式：

回收率=(加入标品后含量-样品含量)/加入标品量×100%

细胞上清与标准品分别为0.5∶1，1∶1，1.5∶1的体积比混合定量后，工作标准品的回收率98.90%～100.40%，说明该方法检测单克隆抗体准确度高，结果见表1。通过样品的重复性考察，得RSD为2.17%，中间精密度的RSD为2.52%，说明运用BLI技术定量检测方法精密度高(表2)。

表1 样品不同添加量的回收率

表2 精密度检测结果

2.5溶液的稳定性和耐用性试验结果 使用相同的protein A生物传感器，样品隔5，15，25，30和45 d分别进样，150 μg/mL的阳性对照样品测试值分别为155.2，141.8，147.7，148.1，148.2 μg/mL。经计算，阳性对照浓度值的RSD为3.7%，protein A生物传感器重复使用60次，说明样品溶液稳定、传感器可重复利用次数多。根据耐用性试验方法，每个变化条件下重复进样2次，总计16次。再生液甘氨酸pH变化±0.2、平衡液吐温-20比例变化±5%的RSD值为0.99%，甘氨酸pH值、PBST溶液中吐温-20含量的变化不影响检测方法的耐用性(表3)。

表3 耐用性检查结果

检测温度变化±5 ℃、转盘速度变化±20%是影响样品定量检测的因素，转盘速度变化-20%时对检测结果影响最大(表4)。检测温度和转盘速度的改变影响样品与protein A传感器的结合速率，从而影响定量结果。

表4 考察结果的影响因素

2.6Octet检测结果与UPLC-protein A检测结果的差异 分别使用Octet和UPLC-protein A两种方法检测25个细胞上清的表达量，Octet检测结果与UPLC-protein A结果高度一致(R2=0.90)(图3)。

3 讨 论

在筛选高产、稳定的单克隆细胞株的过程中，需快速、准确地对挑选的细胞进行定量检测，以便对细胞株进行筛选和排序;在挑完克隆进行大规模培养时，需对蛋白表达进行检测与监控。本研究运用BLI技术，使用Octet分子相互作用分析仪和protein A生物传感器，能实现对单克隆抗体高通量定量检测。该种定量方法具有很多突出的优势，如：样品适用性强，分析过程不受各类培养基及杂质影响；分析前，样品不需进行复杂的前处理步骤，收到样品可立即检测；分析样品用量少、可回收；与UPLC-protein A结果比较，检测时不需要每次都建立标准曲线，节省工作标准品的消耗；UPLC-protein A检测一个样品需要10 min，该种定量方法能一次检测8个样品，每次检测耗时约2.5 min，能在30 min检测80个样品的浓度，分析速度提高了27倍，实现对样品的高通量检测。

本研究运用BLI技术，建立了高通量定量检测单克隆抗体的方法，并进行了方法学验证，主要考察了专属性、线性、检测限和定量限、准确度、精密度和中间精密度、溶液稳定性、系统耐用性。结果表明，protein A传感器能特异性地与单克隆抗体结合，不受其他杂质干扰，抗体的浓度与结合速率之间呈良好的回归关系，相关系数R2为0.999 9；检测限为0.6 μg/mL，定量限为2 μg/mL；该方法准确度高；重现性好；再生液pH、平衡液吐温-20比例变化不影响检测系统的耐用性，检测温度、转盘速度变化是影响样品定量检测的因素。

本研究建立的高通量定量检测单克隆抗体浓度的方法，符合方法学验证要求，浓度测定结果与UPLC-protein A结果相比，有很好的可比性，同时省去样品前处理过程，操作更简便。在挑选高产细胞株时，该方法能准确、快速地进行定量检测，实现对细胞株进行筛选、排序以及蛋白表达的检测与监控。