沉默Rbfox1对癫痫模型大鼠海马神经细胞生物学行为的影响及机制研究

冯磊，解利平，张海平，束坤

癫痫是因大脑神经元出现突发性异常放电所引发的脑部功能障碍类疾病，其临床表现为自主神经、意识、精神障碍及发作性运动[1]。海马区是中枢神经系统内对癫痫发生最为敏感的脑区，在癫痫发生后会导致海马神经细胞发生坏死或凋亡，且癫痫发作后对大脑所产生的损伤受海马神经元凋亡的影响，因此通过抑制海马神经元凋亡可修复神经元损伤[2]。沉默结合RNA的Fox1基因(Rbfox1)在临床上又被称为A2BP1，参与神经系统发育过程，可同时调节神经元兴奋和参与转录过程， Rbfox1基因突变与智力发育迟滞、癫痫相关[3]。本研究分析沉默Rbfox1基因对癫痫模型大鼠海马神经细胞生物学行为的影响及其机制，为临床癫痫治疗提供新方向，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物： SD健康雄性大鼠(SPF级)60只(由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供)，体质量220～240 g，饲养温度22～25℃，室内湿度35%～40%，饲养室定时进行紫外线照射消毒。统一喂给标准饲料，允许自由活动，饲养时间为1周。本实验获得医院伦理委员会批准。(2)试药试剂：氯化锂(上海源叶生物科技有限公司)、匹罗卡品(上海熹恒生物科技有限公司)、硫酸阿托品(华中药业股份有限公司)、戊巴比妥(上海上药新亚药业有限公司)；大鼠抗小鼠p-p38抗体(北京华夏远洋科技有限公司)，大鼠抗小鼠p-JNK抗体(厦门嘉慧生物科技有限公司)；大鼠抗小鼠p-Erk抗体(厦门研科生物技术有限公司)，兔抗大鼠Bax抗体，兔抗大鼠Bcl-2抗体(武汉菲恩生物科技有限公司)，兔抗人Bim抗体(上海振誉生物科技有限公司)。(3)仪器：光学显微镜(美国Ted Pella)。

1.2 实验方法 2019年8月—10月于西电集团医院神经外科实验室进行实验。

1.2.1 慢病毒载体构建： Rbfox1表达沉默的慢病毒载体构建、大鼠Rbfox1序列查找及设计由上海GeneChem公司完成，重组Rbfox1过表达病毒载体(Lentiviral-mediated-Rbfox1)、Rbfox1沉默载体(Lentiviral-mediated-Rbfox1-RNAi)由上海GeneChem公司合成，并经测序验证后行慢病毒载体构建，病毒滴度为108TU/ml，在制备完成后将重组慢病毒载体在温度为-80℃下保存。

1.2.2 建模及分组：随机选取60只大鼠中15只作为空白对照组，其余大鼠均参照陈姝璇等[4]研究中运用氯化锂—匹罗卡品化学点燃制备癫痫模型，将氯化锂 3 mEq/kg(125 mg/kg)注射于大鼠腹腔，之后18～24 h将硫酸阿托品1 mg/kg注射于大鼠腹腔，在此0.5 h后以匹罗卡品首次剂量30 mg/kg注射于大鼠腹腔， 0.5 h后观察大鼠是否出现Ⅳ级以上癫痫发作，若无可每隔0.5 h腹腔注射匹罗卡品10 mg/kg，直至大鼠出现Ⅳ级以上无明显间歇的癫痫持续状态。将建模成功的癫痫大鼠模型按随机数字表法分为模型组、过表达组、沉默组各15只，在无菌环境下将所制备的Rbfox1过表达病毒载体重组慢病毒悬液10 μl注射于过表达组大鼠海马区，Rbfox1沉默载体重组慢病毒悬液10 μl注射于沉默组大鼠海马区，正常对照组和模型组不做处理。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 大鼠海马神经元病理变化：在慢病毒转染1周后观察大鼠海马神经元病理变化。随机选取各组大鼠1只，腹腔注射3.0%戊巴比妥 80 mg/kg麻醉，迅速取大鼠脑组织，分离海马组织制作标本，使用4%多聚甲醛固定，常温下使用15% EDTA脱钙，脱水后进行石蜡包埋，制作厚3 μm组织切片，行HE染色，以光学显微镜观察大鼠海马神经元病理变化。

1.3.2 大鼠海马神经细胞增殖/凋亡情况检测：在慢病毒转染1周后检测大鼠海马神经细胞增殖/凋亡情况。选取每组大鼠7只腹腔注射3.0%戊巴比妥80 mg/kg麻醉，迅速取脑组织，分离海马组织，运用酶消化法采集大鼠海马神经细胞，加入PBS制备成单细胞悬液，调整细胞数为1×106个/ml。采用MTT比色法检测大鼠24、48、72 h时海马神经细胞增殖能力，增殖率=(细胞组OD值/参照值-1)×100%，计算大鼠海马神经细胞增殖率。采用流式细胞仪检测大鼠24、48、72 h时海马神经细胞凋亡情况。

1.3.3 大鼠海马组织中MAPK通路蛋白表达检测：在慢病毒转染1周后检测大鼠海马组织MAPK通路蛋白表达情况。4组各剩余7只大鼠均腹腔注射3.0%戊巴比妥 80 mg/kg麻醉处死，迅速取脑组织，分离海马组织在液氮中保存、待用，采用Western-blot法检测大鼠海马组织中MAPK通路蛋白p-p38、p-JNK、p-Erk及下游调控蛋白Bax、Bcl-2、Bim表达量，内参蛋白设置为GAPDH。

2 结 果

2.1 4组大鼠海马神经元病理变化比较 空白对照组大鼠脑皮质、颗粒细胞、齿状回锥体细胞排列轮廓清晰、紧密， 胞核呈圆形或椭圆形， 核仁清晰，染色质均匀，胞浆透明，周围有大量胶质细胞分布；模型组大鼠海马神经元排列紊乱，细胞发生破裂、膨胀，尼氏小体减少；过表达组大鼠海马神经元细胞排列较为紊乱，细胞水肿显著增大，细胞间距加大；沉默组大鼠海马神经元细胞无水肿，细胞间距变小，排列整齐，尼氏小体增加，神经元存活数目增多，见图1。

2.2 4组大鼠海马神经细胞凋亡率比较 模型组不同时间点大鼠海马神经细胞凋亡率高于空白对照组(P<0.01)，且过表达组>模型组>沉默组(P<0.01)，见表1。

表1 4组大鼠海马神经细胞凋亡率比较

2.3 4组大鼠海马神经细胞增殖率比较 模型组不同时间点大鼠海马神经细胞增殖率低于空白对照组(P<0.05)，且过表达组<模型组<沉默组(P<0.01)，见表2。

表2 4组大鼠海马神经细胞增殖率比较

2.4 4组大鼠海马组织中MAPK通路蛋白表达量比较 模型组大鼠海马组织p-p38、p-JNK、p-Erk、Bax、Bim蛋白高于空白对照组，Bcl-2蛋白低于空白对照组(P<0.05)，p-p38、p-JNK、p-Erk、Bax、Bim蛋白表达比较，过表达组>模型组>沉默组，Bcl-2蛋白过表达组<模型组<沉默组(P<0.01)，见表3。

表3 4组大鼠海马组织中MAPK通路蛋白表达量比较

3 讨 论

癫痫的发生与中枢神经系统感染、遗传、脑卒中等因素相关[1]。但目前临床上对于影响癫痫大鼠海马神经细胞生物学行为的机制尚不完全明确，随着对癫痫发病机制的研究不断深入，目前认为癫痫的发生与多种基因有关，如KCNT1基因、PRRT2基因、DEPDC5基因等。在本研究中通过沉默Rbfox1基因，分析沉默基因对癫痫模型大鼠海马神经细胞生物学行为的影响，为临床研究癫痫提供新方向。

Rbfox1基因大小为1 694 246 bp，主要位于16p13.3，可影响神经元兴奋，因此临床研究认为[5-6]，Rbfox1基因可能与癫痫的发生相关。选择性剪接以不同的结合方式与外显子连接，可影响神经发育，改善脑部功能，参与多种神经系统性疾病的发生。研究认为[7-9]，Rbfox1基因可通过与外显子两翼的内含子中(U)GCAUG序列选择性结合，影响神经系统选择性剪接作用。目前研究发现[10-12]，Rbfox1基因所调控的靶基因包括上皮特异性纤维母细胞生长因子、纤连蛋白基因、GABRB3、GAD2、GABA-A受体γ2的基因等，其所编码的蛋白质可与微管结合蛋白、激动蛋白等参与细胞构架、迁移、变形过程。Lal等[13]研究认为，Rbfox1基因外显子缺失会增加特发性全身性癫痫的风险。临床研究中发现[14]，Rbfox1基因参与顽固性癫痫的发生，且经动物实验发现，Rbfox1基因在神经元中呈上升趋势。相关研究表明[15]，当癫痫发生后可诱发神经元死亡，表现为神经细胞凋亡，根据神经细胞凋亡现象可间接反映癫痫的疾病发作程度。本研究构建Rbfox1基因过表达和沉默慢病毒载体，检测Rbfox1基因沉默和过表达对癫痫大鼠海马神经细胞增殖、凋亡的影响，结果显示，与Rbfox1基因过表达相比，Rbfox1基因沉默的大鼠海马神经细胞凋亡率较低，海马神经细胞增殖率较高，且基因沉默的大鼠海马神经细胞凋亡率与增殖率在72 h时与空白对照组差异无统计学意义，此结果提示Rbfox1基因在癫痫大鼠中高表达，可通过沉默其表达修复受损神经细胞，抑制海马神经细胞凋亡，进而改善癫痫症状。

MAPK信号通路参与神经系统疾病的发生发展，临床可通过抑制MAPK通路蛋白异常表达而减轻神经细胞损伤，MAPK信号通路起主要调控的信号转导路径包括p38通路和JNK通路，参与细胞生物学行为。聂荔等[16]探究沉默MAPK通路对大鼠癫痫持续状态引起海马神经元损伤的保护作用，其研究证实，抑制MAPK通路可修复海马神经元损伤，抑制海马神经元凋亡。本研究发现，沉默Rbfox1基因可利于癫痫大鼠海马神经细胞增殖，抑制凋亡，为进一步明确沉默Rbfox1基因影响海马神经细胞的机制，采用Western-blot法检测4组大鼠海马组织中MAPK通路蛋白表达量，结果显示，沉默Rbfox1基因的大鼠海马组织中MAPK通路蛋白表达量显著降低，且与空白对照组比较差异无统计学意义，此结果提示，沉默Rbfox1可能通过作用于MAPK通路发挥其调控海马神经细胞生物学行为的目的。但目前并无沉默Rbfox1基因与MAPK通路调控癫痫大鼠海马神经系统生物学行为的研究，因此本研究结果还需后续实验进一步证实。

综上所述，沉默Rbfox1基因可抑制海马神经细胞凋亡，促进海马神经细胞增殖，其作用机制可能与调控MAPK通路相关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

冯磊：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；解利平：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；张海平：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；束坤：进行统计学分析