2型糖尿病患者胰岛素抵抗与外周血单个核细胞miR-181a、miR-9的关系

李伟，李霞，徐杰，白小岗，白婷

糖尿病是由多种病因引发的代谢性疾病，其特点为慢性高血糖，并伴有胰岛素分泌或作用缺失，诱发蛋白质、糖和脂肪代谢紊乱[1]。胰岛素抵抗、胰岛β细胞功能障碍是2型糖尿病的病理基础[2]。微小RNA(miRNA)在2型糖尿病中可参与胰岛细胞的发育、糖代谢及并发症等过程。已有报道称，miRNA在胰岛素主要效应器官如脂肪细胞、肝、骨骼肌等中过表达可导致胰岛素抵抗[3]。微小RNA-181a(microRNA-181a，miR-181a)可调节功能蛋白的表达及信号通路，参与细胞多项生理活动。研究表明，miR-181a在多种疾病及肿瘤中异常表达，参与疾病或肿瘤的发生发展[4]。微小RNA-9(microRNA-9，miR-9)在多种人类疾病中表达异常，如miR-9在肝癌患者血清外泌体中表达水平低于正常供体[5]。miR-181a、miR-9在2型糖尿病中对胰岛素抵抗的作用少见报道，现分析2型糖尿病患者外周血单个核细胞(PBMC)中miR-181a、miR-9表达及其与胰岛素抵抗的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年12月—2019年12月延安大学附属医院内分泌代谢科诊治2型糖尿病患者97例作为观察组，其中男50例，女47例，平均年龄(46.73±10.25)岁；平均体质指数(BMI)(24.78±3.23)kg/m2；平均收缩压(127.82±12.13)mmHg，平均舒张压(78.24±10.63)mmHg；有糖尿病家族病史32例，高血压21例，饮酒26例，有吸烟史38例。选取同一时间在医院进行常规体检的健康者93例作为健康对照组，其中男47例，女46例，平均年龄(45.36±10.57)岁，平均BMI(23.54±2.65)kg/m2；平均收缩压(125.36±11.78)mmHg，平均舒张压(77.81±10.32)mmHg；饮酒23例，有吸烟史34例。2组受试者的性别、年龄、收缩压、舒张压、饮酒及有吸烟史者比例比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，观察组BMI高于健康对照组(P<0.05)。本研究经延安大学附属医院伦理委员会批准，所有受试者及家属知情且签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1) 纳入标准：①符合《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》中关于2型糖尿病的诊断标准[6]；②病程在1年以内；③未接受降糖治疗者。(2)排除标准：①患有恶性肿瘤者；②近期外伤者；③合并肝、肾等疾病者；④急慢性感染性疾病者。

1.3 观测指标与方法 患者入院翌日清晨、体检者当日取其空腹外周静脉血7 ml，保存于真空抗凝采血管中；其中2 ml血液离心得血浆存于-80℃冰箱，检测生化指标，另外5 ml血液用于提取PBMC。并采集所有受试对象餐后2 h的静脉血2 ml,用于检测餐后2小时血糖(2hPG)。

1.3.1 空腹胰岛素(FINS)及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)：采用微粒子化学发光法测定FINS， 采用稳态模型计算HOMA-IR值，计算公式：HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.3.2 空腹血糖(FPG)、2 hPG、糖化血红蛋白(HbA1c)测定：采用全自动生化分析仪(BS-360E型，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)测定FPG、2 hPG，采用多功能全定量金标检测仪(NO202M型，济南奥诺生物工程有限公司)检测HbA1c。

1.3.3 PBMC制备：上述血液5 ml加入等量PBS缓冲液[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]，混合均匀后加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，离心收集白膜层细胞，移至新离心管中，PBS重悬洗涤，再以Ficoll 密度梯度离心法离心留取管底部的细胞团块即为PBMC。将PBMC加入TRIzol(日本TaKaRa公司) 1 ml进行裂解，-80℃保存，用于提取RNA。

1.3.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定miR-181a、miR-9表达检测：从-80℃取出PBMC样本，严格按TRIzol试剂说明书提取总RNA，检测RNA纯度及完整度；严格按照逆转录试剂盒(北京天根生化有限公司)说明书将RNA逆转录为cDNA，产物置于-20℃保存。qRT-PCR反应(反应体系20 μl)：cDNA模板2 μl， 2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，H2O 6 μl，各个样本设置3次平行。根据目的基因设计相应的上下游引物，均以U6为内参，序列见表1。反应条件：95℃ 30 s,95℃ 10 s、60℃ 20 s，35个循环，在qRT-PCR仪[型号：MiniAmp，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]上进行反应。根据各样本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-181a、miR-9的相对表达量。

表1 miR-181a、miR-9及内参基因U6的引物序列

2 结 果

2.1 FINS及HOMA-IR水平比较 观察组FINS及HOMA-IR水平[(12.78±3.86)μIU/L、4.85±2.37]均明显高于健康对照组[(5.43±0.99) μIU/L、1.23±0.32]，差异有统计学意义(t=17.808、14.601，P均=0.000)。

2.2 2组FPG、2 hPG、HbA1c水平比较 观察组FPG、2hPG、HbA1c水平均明显高于健康对照组(P<0.01)，见表2。

表2 2组血糖、HbA1c比较

2.3 PBMC中miR-181a、miR-9表达比较 观察组PBMC中miR-181a、miR-9的表达量(2.07±0.65、4.25±1.06)均明显高于健康对照组(1.24±0.41、1.37±0.46)，差异有统计学意义(t=10.476、24.113，P均=0.000)。

2.4 HOMA-IR 与PBMC中miR-181a、miR-9表达的相关性 2型糖尿病患者PBMC中HOMA-IR与miR-181a、miR-9表达均呈正相关(r=0.413、0.464，P均=0.000)。

2.5 影响2型糖尿病患者HOMA-IR的多因素分析 将2型糖尿病患者HOMA-IR值作为因变量，以BMI、FPG、2 hPG、HbA1c水平及miR-181a、miR-9表达作为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，BMI、2 hPG、HbA1c、miR-181a及miR-9表达均是2型糖尿病患者发生胰岛素抵抗的危险因素。见表4。

表4 影响2型糖尿病患者HOMA-IR的多因素分析

3 讨 论

糖尿病与心血管疾病、肿瘤并列为三大非传染性慢性疾病，患病人数逐年攀升。糖尿病可分为1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊类型糖尿病，其中2型糖尿病最为常见[7]。2型糖尿病具有隐匿性，多数由于出现并发症被确诊，病程较长，严重者可致残或死亡，对患者生活质量带来极大影响[8]。2型糖尿病是慢性进展性疾病，随着病程进展，胰岛β细胞功能减退，补充胰岛素是控制2型糖尿病患者高血糖的有效手段[9]。本研究分析2组受试者的一般资料，发现观察组的BMI、FPG、2hPG、HbA1c水平均明显高于健康对照组，提示2型糖尿病患者的多项指标表达异常，影响患者的多种功能。胰岛素抵抗是胰岛素作用的组织、靶器官对胰岛素的反应性降低或丧失而造成的临床病理表现，由多种疾病共同引发，但发病机制尚不明确[10]。胰岛素抵抗在2型糖尿病的发生发展中发挥重要作用，容易诱发糖脂代谢紊乱；同时也存在于肥胖、高血压、高血脂等代谢疾病中影响疾病进程[11-12]。胰岛素抵抗主要发生在肝脏及外周组织(肌肉、脂肪)中，可表现为胰岛素抑制肝糖原输出的能力减弱或骨骼肌、脂肪组织储存利用葡萄糖发生障碍[13-14]。在2型糖尿病患者中，约80%患者伴随胰岛素抵抗，因此临床上对于2型糖尿病的治疗集中于控制血糖和改善胰岛素抵抗两个方面[15-16]。比较2组FINS及HOMA-IR水平，发现观察组FINS及HOMA-IR水平均明显高于健康对照组，提示2型糖尿病患者存在胰岛素抵抗现象。

miRNA是由20～24个核苷酸组成的单链RNA，对大多数的编码基因有调控作用，可作为多种疾病的生物标志物[17]。miRNA可调控多种内源性因子的合成和释放，从而影响机体内葡萄糖的摄取、储存及利用等过程，在2型糖尿病中发挥重要调节作用[18]。miR-181a为 miR-181家族成员，位于人染色体1q32.1处，其5’端存在一段非常保守序列。miR-181a在机体能量代谢异常组织中表达上调，在代谢疾病中发挥调控作用[19]。Lozano-Bartolomé等[20]研究表明，miR-181a在糖尿病患者的脂肪组织中异常表达，改变患者对胰岛素的敏感性，其过表达可抑制TNF-α诱导的胰岛素抵抗。本研究结果中观察组miR-181a表达水平高于健康对照组，提示miR-181a参与2型糖尿病的发生发展并呈高表达，猜测miR-181a参与机体能量代谢机制，其高表达或与糖尿病诱发脂肪代谢紊乱有关；由于糖尿病患者长期处于代谢失调状态，体内炎性反应较高或可诱导体内发生胰岛素抵抗，miR-181a高表达可能通过调节胰岛素敏感性抑制机体的胰岛素抵抗状态。

miR-9位于人15号染色体处，可调节人体内血糖水平。Guo等[21]发现，miR-9在高脂饮食组小鼠血清中呈高表达，miR-9及其靶基因OC-2可影响胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对胰岛β细胞的调节功能，进而影响胰岛素基因表达及胰岛素分泌。Jafarian等[22]认为沉默miR-9会增加胰岛素产生细胞中的OC-2蛋白，抗miR-9处理对人骨髓间充质干细胞分化、葡萄糖调节方式以及胰岛素分泌有协同作用，人骨髓间充质干细胞通过抗-miR-9生成胰岛素生产细胞。本研究结果中观察组miR-9表达水平高于健康对照组，提示miR-9参与2型糖尿病的发生发展并呈高表达，研究猜测miR-9可通过调节胰岛β细胞影响胰岛素分泌，同时抗miR-9处理可能促进胰岛素分泌，而2型糖尿病患者胰岛素分泌失常，猜测miR-9或与胰岛素生产细胞相关。

Pearson法分析结果显示，2型糖尿病患者HOMA-IR与PBMC中miR-181a表达及miR-9表达均呈正相关，提示miR-181a表达及miR-9表达可参与胰岛素抵抗的发生发展，两者间可能存在某种共同作用机制或靶标调节机体胰岛素抵抗情况。对影响2型糖尿病患者HOMA-IR的因素进行分析，结果显示BMI、2hPG、HbA1c、miR-181a及miR-9表达均是2型糖尿病患者胰岛素抵抗的危险因素，提示下调miR-181a表达及miR-9表达可能会降低2型糖尿病发生胰岛素抵抗的几率。

综上所述，miR-181a、miR-9在2型糖尿病患者PBMC中表达上调，且二者均与HOMA-IR呈正相关，表明二者可能参与胰岛素抵抗的发展进程。但由于本研究样本量少，结果可能具有局限性，miR-181a、miR-9对2型糖尿病胰岛素抵抗的作用机制及其在临床中的应用价值，仍需扩大样本量进一步验证。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

李伟：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；李霞：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；徐杰：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；白小岗：进行统计学分析；白婷：课题设计，论文撰写