单宁酶固液发酵对比试验

刘会 周瑞琪 金伟

摘要    通过对比单宁酶的液体发酵和固体发酵发现，固体发酵方式潜力较大、成本低、产率高，且充分利用了农林业废弃物资源，有利于环境和能源的可持续发展。

关键词    单宁酶;固体发酵;液体发酵;农林废弃物

中图分类号    TQ925        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）15-0228-02                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    By comparing the liquid fermentation and solid fermentation of tanninase， it was found that solid fermentation had great potential， low cost and high yield， and made full use of agricultural and forestry waste resources， which was conducive to the sustainable development of the environment and energy.

Key words    tannase; solid fermentation; liquid fermentation; agricultural and forestry waste

单宁酶可用于处理茶饮料“冷后浑”、啤酒沉淀、果汁果酒变质等问题，广泛应用于食品、饮料、制革、化妆、医药等行业[1-2]，近年来还用于医药中间体——没食子酸和相关精细化学品的制备[3-4]。

单宁酶的发酵生产有液体发酵和固体发酵2种方式。液体发酵是传统的微生物发酵方法，具有均一性好、工艺易控制等优点;固体发酵也有其特有的优势，比如培养基成本低、设备和技术较简单、能耗低等。本文对2种发酵生产单宁酶的工艺进行全面的比较，以期为现代发酵工艺研究提供参考。

1    材料与方法

1.1    试验材料

供试菌株：黑曲霉TmF3，由中科院强磁场与离子束物理生物学重点实验室诱变获得。

产孢培养基：PDA培养基。

种子培养基：葡萄糖12 g/L，CaCO3 10 g/L，用改良Mandels营养盐液配制[5]。

液体发酵培养基：籼米粉25 g/L，单宁酸10 g/L，CaCO3 2.5 g/L，（NH4）2SO4 5.0 g/L，KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4 0.15 g/L。

固体发酵培养基：250 mL三角瓶中加入稻壳4.4 g、麸皮0.5 g和五倍子粉1.0 g，液固比2∶1，营养盐溶液组成为（NH4）2SO4 21 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，NaCl 1.0 g/L。

1.2    试验方法

1.2.1    孢子悬浮液配制。从产孢培养基上刮取黑曲霉孢子制成孢子悬液。

1.2.2    液體发酵。取1 mL孢子悬液（约含5.3×107个孢子）接种于含40 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min培养12 h。取2 mL种子液接种于含50 mL液体发酵培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min培养80 h。发酵完成后，滤纸过滤分离发酵液和菌丝体。菌丝体用蒸馏水过滤清洗至无水溶性杂质残留。称取部分湿菌体，按40∶1的比例加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH值5.0），对菌丝体进行超声破碎，超声条件为：功率600 W，工作时间1 s，间隙时间2 s，工作总时间9 min。破碎完成后用滤纸过滤，留取过滤液。发酵液用透过分子量为8 000～14 000的透析膜在4 ℃条件下过夜透析，以除去没食子酸。再称取部分湿菌体，于110 ℃烘箱内烘干至恒重，即得干菌体，称重。

1.2.3    固体发酵。每个250 mL三角瓶接种1 mL孢子悬浮液（约5.3×107个孢子），搅拌均匀，30 ℃静置发酵4 d。发酵完成后，按10∶1比例加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH值5.0），搅拌均匀，180 r/min振荡浸提1 h，提出粗酶液。

1.2.4    单宁酶活力测定。测定方法采用比色法[6]。

2    结果与分析

2.1    发酵培养基成分比较

250 mL三角瓶发酵中，固体发酵培养基包含6.17 g固体成分，固态发酵培养基成分大多为天然原料，如稻壳、麸皮为农产品加工废弃物，五倍子粉由林产品粗加工制得，这些天然原料不仅价格便宜且营养成分丰富，不需额外添加微量元素，只需添加少量的大量元素和无机氮源。

液体发酵培养基包含2.21 g固体成分，明显低于固体发酵培养基，但其除了籼米粉为天然原料外，其余成分均为化学试剂，加上种子培养基成分共有13种之多，成分复杂、价格高。另外，液体发酵培养基用水量是固体发酵培养基的4倍多。因此，若用于大规模工业生产，固体发酵成本将远低于液体发酵。

2.2    发酵过程比较

液体发酵生产单宁酶需要进行包括种子培养在内的二级发酵，培养过程较复杂，对发酵控制系统的精度要求很高，而且要求环境和发酵容器有较高的洁净度。另外，诱导物单宁酸对黑曲霉菌体的生长抑制作用十分明显，其含量最高只占培养基组分的2%。

固体发酵则直接孢子接种，无须种子发酵，且为静置培养，发酵过程较为简单。另外，可能由于固体发酵方式更接近于微生物的自然生长环境，黑曲霉在固体发酵中生长更旺盛，对环境中不良因子的耐受力更强，比如更抗杂菌污染，对单宁酸耐受可高达15%等。

2.3    单宁酶提取工艺比较

液体发酵生产的单宁酶，包括胞内和胞外2个部分，因而菌体和发酵液都需要进行提取，而且菌体还需要进行破碎，才能释放胞内的单宁酶;而固体发酵生产的单宁酶几乎全部在胞外，胞内几乎没有。因此，若用固体发酵生产单宁酶，其提纯工序会更简单、效率更高、成本也会降低;而且有报道称，胞外单宁酶与胞内单宁酶的结构不同，固体发酵生产的单宁酶结构均一性要优于液体发酵。

2.4    固液体发酵单宁酶总活力比较

液体发酵结束后，250 mL三角瓶内干菌体含量约为1.18 g，发酵液约为38 mL，胞内单宁酶活力为44 U/g、胞外约为1.56 U/mL，每个摇瓶生产的单宁酶总活力为111.2 U;固体发酵完成后，每克固体基质产生的单宁酶活力平均为115 U，每个摇瓶生产的单宁酶总活力为709.5 U（是液体发酵的6.38倍）。根据2种发酵方式中每个三角瓶所含的干物质量，可计算出每克干物质固体发酵生产单宁酶的效率是液体发酵的2.3倍。

3    结论与讨论

通过单宁酶液体发酵和固体发酵的对比研究发现，固体发酵方法能显著提高胞外单宁酶的产量，且生产成本远低于液体发酵。综合比较2种发酵方式所用培养基、发酵过程、酶的提取方法和酶总活力等可发现，黑曲霉固体发酵生产单宁酶潜力较大，而液体发酵胞内单宁酶丰富，可以根据实际需要采取不同的发酵方式。此外，固體发酵充分利用了人类生产生活中产生的大量农林业废弃物，有利于环境和能源的可持续发展。

4    参考文献

[1] 保玉心，黄永光，李盛，等.单宁酶的性质与应用研究进展[J].酿酒，2007，34（5）：53-57.

[2] 李梦迪.黑曲霉单宁酶TahA在茶饮料品质提升中的作用[D].天津：天津科技大学，2018.

[3] 钱高青，杜冰心，汪竹群，等.微生物单宁酶及其生物技术进展[J].农产品加工，2018（22）：61-64.

[4] 杨顺楷，杨亚力.酶法转化五倍子单宁酸生产没食子酸[J].精细与专用化学品，2005，13（5）：12-13.

[5] 吴克，蔡敬民，刘斌，等.黑曲霉A3木聚糖酶酶学性质研究[J].菌物学报，2000，19（3）：383-388.

[6] 金伟，聂光军，王丽，等.黑曲霉固态发酵生产单宁酶的条件优化[J].生物加工过程，2013，11（3）：7-12.