红外光谱在食药用菌化妆品发酵原料检测中的应用初探

马玉涵 赵岩 孙玉军 李坤

摘  要：相比于传统的基于乳化技术和萃取技术为基础的化妆品生产方法，更加环保天然的食药用菌发酵化妆品受到越来越广泛的关注。然而，发酵过程复杂多变，各种底物、产物、发酵菌种混合其中，构成了一个随时变化的大数据系统。如何将这些数据快速、高通量采集、整合、分析，并对发酵过程进行快速反馈和终点预判，是发酵过程监控的关键。红外光谱分析技术具有全程、在线、无损、高效等众多优点，以大数据处理为基础，利用化学计量学方法，结合神经网络算法、PLS、iPLS等算法和机器学习方法，构建定性与定量模型，可以对发酵产物、发酵过程限制因子、发酵品质予以预判，对发酵过程诸元信息整合，构建发酵终点判定标准，以实现对发酵化妆品原料生产信息的采集监测、集成、分析、解析、策略设计和实时控制。

关键词：红外光谱  化妆品  发酵  无损检测

中图分类号：Q632   文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2020）06（c）-0057-05

Abstract： Compared with traditional cosmetic production methods based on emulsification and extraction technology， fermentation engineering technology have gained more extensive attention. However， the fermentation process is complex and changeable， among which various substrates， products and fermentation strains are mixed， which constitute a large data system that changes all the time. How to collect， integrate， analyze these data quickly， feed back in real time， and prejudge the reaction endpoints of fermentation process are the keys for the monitoring of fermentation process. Infrared spectrum analysis technology has many advantages in fermentation process， including on-line， non-destructive， high efficiency and full-range control. Based on mega data processing， using chemometrics method， combining neural network algorithm， PLS， iPLS and machine learning method， the qualitative and quantitative model can be constructed to realize the monitoring， integration， data analytics， understanding， strategy design and control in the raw material production for fermented cosmetics.

Key Words：  Infrared Spectroscopy; Cosmetic; Fermentation; Nondestructive Testing

1  化妆品发展的发展历程

化妆品，是指以涂擦、喷洒或者其他类似的方法，散布于人体表面任何部位（皮肤、毛发、指甲、口唇等），以达到清洁、消除不良气味、护肤、美容和修饰目的的日用化学工業产品[1]、其发展大致可以分成以下阶段。

第一代是使用天然的动植物油脂对皮肤做单纯的物理防护。即直接使用动植物，或矿物来源的不经过化学处理的各种油脂。这一过程可以追溯到古人类时期[2]，在埃及、古罗马等也有广泛应用[3，4]。

第二代是以油和水乳化技术为基础的化妆品。其代表是表面活性剂的大量使用[5]，也包括香精、防腐剂等化学试剂的合成和使用[6]。这一过程可以追溯到古巴比伦时期[7]，15世纪，这一类型的化妆品在欧洲半工业化生产[8]，18世纪后期，欧美的大工业化的生产开始[9]。世界最大的化妆品巨头之一，联合利华公司，就在这一过程中诞生的[10]。

第三代是添加各类动植物萃取精华的化妆品。化妆品中的化学成分给身体带来的副用作引起人们的关注，于是从20世纪70年代以后，化妆品界又掀起了回归自然的热潮，开始提倡用天然油代替矿物油，井从皂角、果酸、木瓜等天然植物中提取原料。将提取到的胶原蛋白、深海鱼油、超氧化物岐化酶（SOD）、维生素等加入到化妆品中，促进了化妆品的跨越式发展[6]。欧莱雅、雅诗兰黛、资生堂等旗下大量“天然”化妆品系列是此类代表。

第四代是仿生化妆品。即采用生物技术制造与人体自身结构相仿并具有高亲和力的生物精华物质并复配到化妆品中。这一变化主要发生在21世纪。例如玻尿酸[11]、表皮生长因子[12]、神经酰胺[13]等生物活性物质在化妆品中的使用。例如，在欧莱雅的化妆品中，其中CeraVe系列完全以神经酰胺作为主要活性成分，其CeraVe的品牌就来自于神经酰胺（Ceramide）这一名称。

然而，在化妆品中直接加入生物活性物质，甚至激素，对人体也存在潜在的危害，因此受到质疑。我国2019年1月禁止在化妆品中添加含有表皮生长因子成分。与此同时，生物发酵技术用于中草药化妆品的开发，因其多方面的功效，展现出广阔的应用前景[1]。

2  中药-食药用菌双向发酵技术在化妆品原料制备中的优势

发酵类化妆品的开发始于20世纪70年代，日本科学家发现清酒酿造工人虽然年迈，但他们的双手却柔嫩富有光泽，他们从清酒发酵液中分离得到一种酵母pitera，以此发酵获得化妆品原料，从而开发出了具有世界影响的品牌SK-Ⅱ[14]。后续的，雅诗兰黛、欧莱雅等化妆品巨头也陆续开发了雅诗兰黛小棕瓶、海蓝之谜系列等[15]。上述发酵均以酵母菌作为出发菌株，通过对培养基中糖类物质的发酵获得发酵产物，其中的药理活性成分较少。药用化妆品市场发展迅速，前景广阔[16，17]。如果能将发酵技术与药用药用成分结合起来，则会兼具二者优点，发挥乘数效应。“双向发酵”技术在化妆品原料生产中的使用成为必然。所谓“双向发酵”是指采用具有一定活性成分的中药材或药渣作为药性基质来代替传统的营养基质，并把经过优选的菌种加入其中进行微生物转化，它们构成的发酵组合称作药用菌质。其双向性体现在药性基质在提供真菌所需营养的同时，还受到真菌中酶的影响而改变自身的组织、成分，产生新的性味功能[18]。

双向发酵技术在中药化妆品原料制备中具有多重优势：（1）提高中药中活性成分的利用效率;（2）降低中药原料的不良反应;（3）成分更加天然，具有更好的肤感;（4）具有一定的抗菌作用。

3  基于机器学习的诸元信息采集反馈系统是发酵过程监督的关键

相比于加入各种化学制剂的配方化妆品生产方式，发酵式的化妆品生产方式调控更为复杂。其中发酵体系中的参数诸元（初始底物种类浓度、培养基、菌种，发酵过程中的供氧量、pH等）时刻发生了复杂的生物和化学变化[19]。传统的发酵控制往往依赖于工人的经验，利用取样孔取样结果，通过对个别参数的判断实施对发酵体系的监督。这一做法的缺陷是显而易见的：无法对发酵体系进行实时监控，对每一种产物的检测都需要单独的检测方法，无法实现信息的整合和高通量分析，在对多种产物进行分析和发酵体系优化控制时具有明显的局限性。这在大数据和机器学习尚未普及的时代是正常的，但显然无法适应发酵产业的快速发展。

发酵过程的众多参数构成了一个实时变化的大数据集合。如何将这些数据高效、无损、实时、在线的采集、整合、分析，并对发酵过程进行实时反馈和终点预判，是发酵过程监督的主要环节。而其中的发酵诸元数据实时、高通量、无损、在线采集，是后续数据分析整合的基础，是实现发酵过程智能监督的关键。

4  红外光谱技术在生物检测中的优势

光是人类对世界的最初方式，利用光对物质的认识有众多优点，如无损、快速。但常见的可见光只是电磁波中很小的一部分。1800年，威廉·赫歇尔发现了红外线（红外辐射），揭开了人类对可见光范围外电磁波认识的序幕[20]。

分子振动的能量与红外射线的光量子能量正好对应，因此当分子的振动状态改变时，就可以发射红外光谱，也可以因红外辐射激发分子而振动而产生红外吸收光谱[21]。红外光谱可分为3个区段，分别为近红外（13330cm-1到4000cm-1）、中红外（4000cm-1到400cm-1）和远红外（400cm-1到10cm-1）谱段。化合物的基频和合频信号较强，而它们一般介于中红外和近红外范围内，是红外光谱常用的区段[22]。红外光谱可以探测到物质分子的基团和键的振动，可以感受到物质中旧键的断裂和新键的生成，从而对化学分子的变化过程加以分析[23-25]。在生物学领域，除了常见的红外热成像以外，红外光谱也有广泛的应用：例如，利用原子力显微镜结合红外光谱，可以研究高粱表皮的内外表面的蜡聚合体结晶度和化学官能团的表面分布[26];将红外光谱分析技术与蛋白质组学方法结合，可以对膀胱癌的肿瘤标志物加以研究，判断膀胱癌的潜在发生可能[27];将红外光谱、拉曼光谱和扫描电镜研究相结合，可对皮肤癌发生过程中的分子糖基化过程予以识别[28];利用功能近红外光谱的成像技术，可以用来对自闭症患者大脑信息传递过程进行研究，有助于实现神经发育过程障碍的早期判断[29]等。

与其他检测方法相比，红外光谱具有多方面的优点：（1）可以对体系中的多种物质同时进行检测，具有高通量的特点和多信息整合性[30，31];（2）根據体系中某一组分的特征性峰位，对特定物质进行指纹鉴定[32，33];（3）不同于传统的化学测量方法，红外光谱检测无需对样品进行处理，可以实现原位（in-situ）无干扰和无损检测，这对需要维持原始状态的检测体系非常重要[34，35];（4）红外光谱检测速度快，无论中红外还是近红外光谱，一个样品的64次扫描都在1min以内，适合于变化的过程的实时检测[36，37];（5）可实现定性判断和定量分析的统一[38，39]。

这些特点对于生物体系这一复杂的系统尤为重要：生物系统作为开放复杂的实时变化体系，如何从离体的ex-situ到in-situ，一直是研究过程的难题[39]。传统的化学分析方法对离体的静止分析到活体的动态过程监控是生物体系研究的必然趋势，而光谱学的分析方法是可以胜任这一工作的有力武器[40]。

5  红外光谱在线检测是发酵体系诸元信息采集整合的基础

活体生物如此，微生物发酵体系也会如此。在这一过程中，底物、产物、菌种、培养基混合在一起，pH值、温度、溶氧量随时变化，而这些有专门的探头可以检测[41];但底物、产物、多种培养基组分如何分析？是否每种组分都需要有专门的检测器？此时，红外光谱的优势彰显无遗[42]。

（1）利用红外光谱可以对发酵产物进行定性和定量分析。

Ma等（2018）利用摇瓶发酵，可以同时将灵芝发酵过程中最关键的药用成分——灵芝多糖和灵芝三萜鉴定出来，并对其进行了非在线的定量分析，构建了良好的摇瓶发酵体系的灵芝多糖和灵芝三萜的定性与定量分析模型[38]。赵岩等（2016）构建了酸奶发酵过程中的蛋白质、脂肪、碳水化合物等的定量分析模型这些结果表明，利用红外光谱（中红外和近红外光谱）在非在线条件下可以对发酵体系中的目标产物进行有效的定性与定量分析，其检测结果与化学测定结果一致[43]。

（2）利用紅外光谱可以对培养基中的发酵限制性因素予以排除。

Vann（2017）利用30L发酵罐对大肠杆菌进行批量发酵，以培养生产绿色荧光蛋白的研究发现，利用近红外光谱，可以发现发酵培养中的限制性因素，并通过对发酵体系中补充维生素B组达到优化发酵体系的目的[42]。

（3）红外光谱信息可以对发酵体系进行质量控制。

Cervera（2009）的研究表明，利用近红外光谱可以对发酵过程进行质量控制，提供发酵过程中底物、生物量、产物和代谢物浓度的在线信息，将近红外光谱和电子鼻相结合，可以有效地发现发酵过程中的污染现象[19]。此前该课题组在小规模发酵培养中，也发现了体系中的杂菌存在会造成红外光谱的微小变化，并可以利用主成分分析予以识别。

（4）红外光谱可以对发酵体系诸元信息加以整合，实现发酵体系的优化。

红外光谱分析是对体系中的各种成分的光谱信息进行综合判断，是对体系整体进行分析，从而克服了传统分析方法中各种检测在时间和空间上的分隔和限制，避免了单独项目检测的时间差，避免了顾此失彼，有利于对多种信息进行优化整合。发酵过程中，当光谱信息满足特定条件时，即达到了发酵反应终点。从而可以根据需要对某一产物或者多种产物的发酵生产进行反馈监控，利于发酵体系的优化。Vann（2017）的研究中，将近红外光谱作为发酵体系的检测器和效应器，是信息流的核心节点，在多种信息整合、分析过程中具有关键作用[42]。

6  基于机器学习的红外光谱大数据解析和反馈可以实现对发酵全程监督

不同于中红外光谱中各峰位代表明确的化学分子基团振动，近红外光谱作为分子基团振动的倍频和合频，其化学信息往往难以解读。因此，在众多实验技术中，近红外光谱也成为最早一批将机器学习方法引入数据解析的领域之一。不同于当今对人工智能研究的火热，早在20世纪80年代，就有了利用人工智能对红外光谱信息解析的报道[44]，人们很早就将神经网络算法、偏最小二乘法等方法用于训练集和预测集的定量模型构建;用主成分分析、聚类分析等方式提取数据信息，用类比较的软独立建模（SIMCA）等方法对样品集予以分类鉴定等[42，45]。

然而，受到计算能力的限制，早期的机器学习仅能对离线的部分光谱数据进行非在线解析[44]。随着大数据、云计算和人工智能技术的广泛应用，对发酵过程等大数据的多元信息解析成为可能，并为反馈控制和发酵终点预判奠定了基础[45]。

为此，Vann（2017）等提出，构建基于近红外光谱的信息采集监测、集成、分析、解析、策略设计和控制（Monitoring， Integration， Data Analytics， Understanding， Strategy Design and Control，MIDUS）体系，可以实现对发酵的全程高通量和高效监控，在发酵化妆品原料生产控制中具有广阔的应用前景[42]。

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