新疆野苹果内生娄彻氏链霉菌A-m1的鉴定和发酵条件优化及抑菌广谱作用*

李永丽 王亚红 周 洲 曲良建

(1. 河南科技大学林学院 洛阳 471023； 2. 中国林业科学研究院森林生态环境与森林保护研究所, 国家林业和草原局森林保护重点实验室 北京 100091)

新疆野苹果(Malussieversii) 又名塞威氏苹果，是我国重要的野生果树资源，为现代栽培苹果的原始祖先(闫鹏等， 2016)。在长期的进化过程中，新疆野苹果拥有丰富的遗传多样性，具有抗旱、抗寒、抗病虫和耐瘠薄等特点(马闯等， 2018)，引起众多研究者的关注。关于新疆野苹果的研究多集中在种群、生态及遗传特性方面(田润炜等， 2016； 陈学森等， 2006； 吴传金等， 2008； 冯涛等， 2006)，种子萌发特性(闫秀娜等， 2015)、繁育特性(秦伟等， 2010)、环境抗逆(徐彦等， 2010； 于玮玮等， 2016)和种质资源(秦伟等， 2011) 等，但有关新疆野苹果内生菌的研究鲜有报道。笔者课题组已对新疆野苹果内生细菌和内生真菌进行了较为系统的分离研究，已获得对苹果病原菌具较好生防潜力的内生细菌7株(李永丽等， 2020) 和内生真菌5株(王亚红等， 2020)。

链霉菌(Streptomyces) 可产生多种对植物病原菌有拮抗作用的次生代谢产物，内生链霉菌广泛分布于植物的根、茎、叶、果实和种子中。从植物体内分离的链霉菌具有很高的应用价值，很多链霉菌已经被开发用于植物病害生物防治(Coombsetal., 2003； 梁亚萍等， 2007； 涂璇等， 2008； 陈红兵等， 2011； 王靖， 2011； 李庆蒙等， 2013； 沈玥， 2014； 张志斌等， 2015； 王相晶， 2015)。目前，新疆野苹果内生链霉菌的研究尚未见报道，有待开发其资源。笔者课题组从新疆野苹果枝干中分离得到1株内生链霉菌菌株A-m1，初步发现其具有强烈的抑菌活性，活性超过之前分离的内生细菌(李永丽等， 2020) 和内生真菌(王亚红等， 2020)。本试验通过对菌株A-m1菌落培养性状、形态特征和理化性质研究，以期明确其分类地位，优化其发酵条件，并探究对苹果等病害病原物的抑菌活性和抑菌广谱性，为相关病害的生物防治以及该菌株的进一步应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试病原菌： 葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、苹果拟茎点霉(Phomopsismali)、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、君子兰茎基腐尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、南天竹炭疽菌(Colletotrichumkarstii) 均由河南科技大学林业生物技术实验室分离保存。

培养基： NA培养基、LB培养基、PDA培养基(方中达，1998)、PDB培养基、高氏一号培养基(中国科学院微生物研究所放线菌分类组，1975)、ISP2培养基、ISP3培养基、ISP4培养基、ISP5培养基、PSA培养基、明胶液化培养基、淀粉水解培养基、纤维素水解培养基、柴斯纳琼脂(Tresner) 培养基、酪氨酸培养基、碳源利用基础培养基、氮源利用基础培养基、Bennett培养基、牛奶凝固与胨化培养基(李其利， 2011)。6种基础发酵培养基，代号分别为 A、B、C、D、E和F。A： 高氏一号液体培养基(戴蓬博等, 2016)； B： 葡萄糖 10 g、蛋白胨 3 g、NaCl 2.5 g、CaCO32 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.2～7.4(闫建芳等， 2016)； C： 乳糖10 g、牛肉膏10 g、NaCl 1 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、MgSO4·7H2O 0.002 g、蒸馏水1 000 mL、pH7.2～7.4(何红， 2015)； D： 蔗糖 20 g、可溶性淀粉 30 g、蛋白胨 2 g、黄豆粉 8 g、NaCl 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCO33 g、K2HPO4·7H2O 0.5 g、蒸馏水1 000 mL、pH7.2～7.4(王辰等， 2015)； E： NA液体培养基； F： PDB培养基参照方中达(1998)配方。

1.2 试验方法

1.2.1 链霉菌菌株A-m1的分离与鉴定 1) 菌株A-m1的分离与纯化 将新疆野苹果健康枝条韧皮部和木质部分别剪成5 mm × 5 mm 左右的组织块，75%的酒精消毒30 s，1% 次氯酸钠消毒3 min，无菌水漂洗3次后，组织块用稀释分离法分离内生菌(方中达，1998)，涂布高氏一号培养基上，于28 ℃ 恒温培养箱中，黑暗培养。取最后一次漂洗的无菌水做为对照涂布于培养基表面。观察内生菌生长情况，适时挑取有放射状菌丝的菌落划线于PDA培养基上，纯化3次后保存备用。

2) 菌株A-m1培养特征观察 将菌株A-m1分别接种在 ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、PDA、NA、LB、PSA、高氏一号培养基上(中国科学院微生物研究所放线菌分类组，1975； 周德庆，1986)，28 ℃ 培养 10 天，观察统计其培养特征。

3) 菌株A-m1形态特征观察 在PDA培养基上划线接种菌株A-m1，同时在接种位点将灭菌的盖玻片(18 mm×18 mm)斜插入培养基内，在菌物培养箱中28 ℃ 培养4～7 天取出插片，在光学显微镜下观察其气生菌丝、孢子链和孢子的形态特征。

4) 菌株A-m1生理生化特征分析 参照文献(中国科学院微生物研究所放线菌分类组，1975； 周德庆，1986)试验方法测定一系列生理生化特性，包括碳源利用、纤维素水解、产H2S、产黑色素、淀粉水解、牛奶凝固与胨化、明胶液化、耐盐性(1%、3%、5%、7%)，生长温度范围(16、22、28、34、40 ℃)。

“教学”主要反映教师的教学水平、教学创新能力，以及教学成果的社会影响。有关评价要素包括：在各级教学成果评比、教学大赛中获得的成绩，教改课题，教学质量评价（大数据反映的教师所任教班级学科成绩的变化、教师教学情况等）；各级示范课、展示课等。其中，“教改课题”的认可度为中上等（事后访谈得知，有不少调查对象将该项列入了科研类），其他各评价要素的认可度都为高。

5) 菌株A-m1 16S rDNA序列测定 提取菌株A-m1基因组DNA，对16S rDNA序列进行扩增，引物为16SL(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACCT-3′)和16SR(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，扩增程序为95 ℃ 预变性3 min； 98 ℃ 变性10 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，共35个循环； 72 ℃ 延伸7 min。将扩增出的目的片段测序[生工生物工程(上海)股份有限公司]，测序结果在GenBank 数据库中进行Blast相似性比对，下载同源性高的相关菌株序列，使用 Clustal X2进行多序列比对，用MEGA 4.0软件采用邻接法(Neighbor-Joining) 构建系统发育树。

1.2.2 菌株A-m1发酵条件优化 1) 发酵最适基础培养基筛选 将菌株A-m1接种于NA液体培养基，在28 ℃、180 r·min-1培养至OD值1.0时做为种子液。然后取1 mL种子液分别接入装有20 mL基础发酵培养基三角瓶(50 mL)中，28 ℃、180 r·min-1恒温振荡培养4 天，发酵液10 000 r·min-1离心10 min； 上清液在超净工作台中使用无菌微孔滤膜过滤器(孔径0.22 μm) 过滤，取5 mL过滤液加入到 75 mL的PDA培养基中，倒制3个平板，以葡萄座腔菌为指示菌做平板对峙试验，菌丝生长速率法计算抑菌率。抑菌率(%)=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100。

2) 发酵液高抑菌活性最佳碳源筛选 改变高氏一号液体培养基中碳源成分，其他物质不变。碳源含量分别为2% 的可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖、阿拉伯糖和不加碳源。不同碳源培养基中分别加入5% 菌株A-m1种子液，发酵条件及后续抑菌率试验方法同上。

3) 发酵液高抑菌活性最佳氮源筛选 改变高氏一号液体培养基中氮源成分，其他物质不变。氮源含量分别为l% 的硝酸钾、氯化铵、酵母膏、蛋白胨、黄豆粉和不加氮源，进行单因素试验。不同氮源培养基中分别加入5% 链霉菌A-m1种子液，发酵条件及后续抑菌率试验方法同上。

4) 发酵条件优化 采用单因素变量法，评价各发酵滤液对葡萄座腔菌的抑菌率，抑菌试验同1.2.2中1)，确定最佳发酵条件。最适接种量： 设置接种量参数为 2%、4%、6%、8%、10%、15%、20%，在 28 ℃、180 r·min-1发酵条件下培养 4天。最适培养时间： 在最适接种量基础上，发酵时间设置为2、4、6、8、10 天，在28 ℃、180 r·min-1条件下震荡培养。最适发酵温度： 在最适接种量和最适发酵时间条件下，设置温度 20、23、26、29、32 ℃ 培养。在最适接种量、发酵时间及温度基础上，设置初始培养基 pH值 3、4、5、6、7、8、9、10、11和12进行发酵培养。在最适接种量、发酵时间、发酵温度和 pH 值基础上，于500 mL三角瓶中分别装入 50、100、150、200、250 mL液体培养基进行发酵培养。

1.2.3 发酵滤液抑菌谱的测定 在前述最佳碳源、氮源和发酵条件基础上，获得无菌发酵滤液，配制平板方法同，测定对葡萄座腔菌、胶孢炭疽菌、苹果拟茎点霉、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、君子兰茎基腐尖孢镰刀菌和南天竹炭疽菌的菌丝生长抑制率。同时设置1 g·L-1的70% 甲基硫菌灵可湿性粉剂(济南农化有限公司) 和80% 多菌灵可湿性粉剂(一帆生物科技有限公司) 试验组，与A-m1发酵滤液抑菌效果对比。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0软件对试验数据进行Oneway ANOVA方差分析，显著性水平0.05。

2 结果与分析

2.1 菌株A-m1的分离与鉴定

2.1.1 菌株A-m1培养特征 培养特征统计见表1，典型特征见图1。菌株A-m1在不同培养基上气生菌丝初期均为白色，后期生长出孢子堆，菌落颜色多呈现棕色和紫色，基内菌丝多表现出黄色，在多种培养基中可产黄色可溶性色素。

表1 菌株A-m1在不同培养基上的形态特征Tab.1 Morphological characteristics of strain A-m1 on different media

图1 菌株A-m1在不同培养基培养10天的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of strain A-m1 on different media for 10 daysa.ISP2培养基； b.ISP3培养基; c.ISP4培养基； d.ISP5培养基； e.LB培养基； f.NA培养基； g.PDA培养基； h.PSA培养基； i.高氏一号培养基。a.ISP2 medium; b.ISP3 medium; c.ISP4 medium; d.ISP5 medium; e.LB medium; f.NA medium； g.PDA medium; h.PSA medium; i.Gause I medium.

2.1.2 菌株A-m1形态特征 菌株 A-m1 在 PDA 培养基上培养 6 天后，单菌落圆形，直径1～1.5 cm，气生菌丝生长旺盛，产生密集孢子堆，菌落棕色，产黄色可溶性色素。菌丝分枝较多，无横隔膜，孢子链形成初期 2～6 圈螺旋，后期孢子链伸展，孢子长圆形，表面光滑，见图 2。

图2 链霉菌菌株A-m1菌落、气生菌丝及孢子链形态特征Fig.2 Morphological characteristics of colony, aerial mycelium and spore chains of Streptomyces A-m1a. 菌落； b. 气生菌丝； c、d. 孢子链。a. Colony; b. Aerial mycelium; c、d. Spore chain.

2.1.3 菌株A-m1生理生化特征统计 菌株 A-m1 生理生化相关检测指标统计见表 3。生理生化特征是链霉菌近分类鉴别的主要依据，A-m1 与其亲缘特别相近的 3 个种模式菌株进行了比较，包含娄彻氏链霉菌S.rocheiD164(中国科学院微生物研究所放线菌分类组，1975； 信艳娟等， 2012)、哥斯达黎加链霉菌(S.costaricanus)(Esnardetal.， 1995; Guetal.， 2012)、鼠灰链霉菌(S.murinus)(Shamsetal.， 2010; Cuietal.， 2012)。菌株 A-m1 能利用木糖、棉籽糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、果糖、葡萄糖、甘露醇、水杨苷作为碳源； 其中对棉籽糖、甘露醇和水杨苷利用能力较弱，不能利用肌醇和蔗糖。菌株能使牛奶凝固与胨化，30 天后不能使明胶液化，能使纤维素分解和淀粉水解，不产生硫化氢和黑色素。耐盐性结果显示，链霉菌 A-m1 在 NaCl 含量 1%～7% 的培养基中都能生长，7% 条件下生长情况变差。从菌株生长温度测定结果显示，16～40 ℃ 菌株均能生长，22～28 ℃ 条件下生长情况良好，34 ℃ 以上温度菌株生长情况变差。生理生化指标测定表明菌株A-m1属于娄彻氏链霉菌。

表3 菌株A-m1与近缘种之间生理生化特征对比①Tab.3 Comparison of physiological and biochemical characteristics between strain A-m1 and relative species

2.1.4 16S rDNA基因序列进化分析 菌株 A-m1 的 16S rDNA 扩增产物经测序获得 1 390 bp 的序列，同源进化分析构建系统发育树如图3，菌株A-m1(16S rDNA收录号： MK990649.1) 与娄彻氏链霉菌(S.rochei)(16S rDNA收录号： AP018517.1)、鼠灰链霉菌(S.murinus)(16S rDNA收录号： NR 112445) 和哥斯达黎加链霉菌(S.costaricanus)(16S rDNA收录号： NR 041414) 聚在同一分支上，相似性 100%。结合对菌株A-m1的形态观察和生理生化指标的测定，菌株 A-m1鉴定属于娄彻氏链霉菌(S.rochei)，命名为StreptomycesrocheiA-m1。

图3 基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树Fig.3 16S rDNA sequence of strain A-m1 in the phylogenetic tree

2.2 菌株A-m1发酵条件优化

2.2.1 最适基础培养基的确定 统计不同培养基发酵滤液对葡萄座腔菌的抑菌作用，如图4。A、B、C、D、E、F培养基发酵滤液的抑菌率分别为95.05%±1.80%、88.28%±4.75%、3.39%±2.51%、98.18%±0.90%、5.06%±2.74%、2.28%±1.16%。A、B、D 3种培养基获得的发酵滤液抑菌率较高，其中A和D培养基的抑菌率最高，处于同一水平，显著高于另外4种供试培养基。C、E和F 3种培养基发酵液抑菌活性非常低，它们的发酵液基本没有色素，并且气味小，发酵液离心发现其中菌体含量却较多，说明这3种培养基非常有利于菌株A-m1的增殖，但次生产物代谢合成不旺盛。由于A培养基成本更低，且配制操作更简易，因此确定高氏一号培养基为菌株A-m1高抑菌活性最适发酵基本培养基。

图4 菌株 A-m1不同培养基发酵滤液对葡萄座腔菌抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of strain A-m1 from different media fermentation broth against B. dothidea

2.2.2 最适碳源和氮源的确定 不同碳源培养基菌株A-m1发酵滤液所表现的抑菌活性，如图5A。抑菌率大小排序： 可溶性淀粉 > 阿拉伯糖 > 麦芽糖 > 葡萄糖 > 果糖 > 不加碳源 > 木糖。可溶性淀粉作为唯一碳源时，菌株A-m1对葡萄座腔菌抑菌率为93.69%±1.52%，抑菌活性显著高于其他碳源。因此，可溶性淀粉做为菌株A-m1发酵最适碳源。

不同氮源培养基菌株A-m1发酵滤液所表现的抑菌活性，如图5B。抑菌率大小排序： 硝酸钾 > 酵母膏 > 黄豆粉 > 蛋白胨 > 不加氮源 > 氯化铵。硝酸钾和酵母膏作为氮源时，发酵滤液的抑菌活性处于同一水平，抑菌率分别为93.69%±1.52%和93.45%±2.63%，显著高于与其他氮源成分发酵率液的抑菌活性。由于硝酸钾成本更低，确定硝酸钾做为菌株A-m1发酵最适氮源。

图5 不同碳源、氮源条件下菌株A-m1发酵滤液抑菌活性Fig.5 The inhibition effect of different carbon and nitrogen sources on fermentation broth of strain A-m1

2.2.3 菌株A-m1发酵条件的优化 接种量在2%～20% 范围内增加，发酵滤液对葡萄座腔菌的抑菌率的趋势(图6A)呈先增加、趋于平稳、后下降。抑菌率分别为45.77%±2.55%、92.59%±2.42%、91.27%±2.10%、93.39%±1.21%、92.86%±0.79%、85.71%±3.64%、85.71%±2.75%。 4%、6%、8%、10% 的接种量抑菌率差异不显著，抑菌率处于最高水平； 从使用种子液量少考虑，4% 为最佳接种量。

4%接种种子液，培养2～20 天发酵滤液产生的抑菌作用先增加后降低(图6B)，抑菌率分别为69.83%±2.56%、92.96%±1.86%、95.66%±1.05%、91.48%±1.84%、90.00%±1.84%、85.44%±1.46%、87.62%±0.73%。4天和6天的抑菌活性最强，两者之间处于同一水平，但显著高于其他培养时间； 从节省培养时间考虑，4 天为最佳发酵培养时间。

4%接种量分别在 20～32 ℃ 条件发酵培养 4 天，统计发酵滤液抑菌率(图6C)。各温度条件下发酵滤液抑菌活性都很强，其中 23、26、29、32 ℃ 培养温度对应抑菌率最高，处于同一水平； 从节约能源考虑，可以从 23～32 ℃ 温度区间选择接近环境的温度进行培养。

培养基初始pH3～12范围，按 4% 接种量、23 ℃、培养4 天发酵滤液的抑菌率先增加后降低(图6D)。pH6、pH7、pH8时处于同一显著水平，抑菌率最高； A-m1发酵起始最适pH6～8之间均可。

培养基 pH7， 4% 接种量，23 ℃ 培养4 天，容量为500 mL 的三角瓶装液50～250 mL对应抑菌率先增加后减小(图6E)。50 mL和100 mL装液量得到的抑菌率最高，两者处同一水平； 从单位容器产量高考虑，100 mL/500 mL作为最佳装液量。

菌株A-m1较合适的发酵条件综上应设置为 4% 接种量，装液量100 mL/500 mL、pH值6～8之间、发酵温度 23～32 ℃ 和发酵培养4天。

2.3 菌株A-m1发酵滤液抑菌广谱性

PDA培养基中加入5 mL最适培养条件下获得的菌株A-m1发酵滤液，对3种苹果枝干病原菌和6种其他植物病原菌均表现出抑菌作用(图7)，说明菌株A-m1具抑菌广谱性。发酵滤液对葡萄座腔菌的抑菌率为95.21%±0.00%，对胶孢炭疽菌的抑菌率为83.08%±1.38%，对苹果拟茎点霉的抑菌率为91.04%±1.55%，对番茄灰霉病菌的抑菌率为77.60%±3.67%，对南天竹炭疽菌的抑菌率为66.88%±1.10%，对君子兰茎基腐尖孢镰刀菌的抑菌率为64.03%±0.82%，对小麦赤霉病菌的抑菌率为82.03%±2.28%，对小麦纹枯病菌的抑菌率为80.89%±0.96%，对小麦全蚀病菌的抑菌率为31.27%±2.13%。对葡萄座腔菌、苹果拟茎点霉的抑菌作用强，抑菌率在90% 以上； 对小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌的抑菌率超过80%，表现出较强的抑菌效果。与甲基硫菌灵和多菌灵抑菌作用相比(表2)，5 mL的菌株A-m1发酵滤液对番茄灰霉病菌的抑制作用高于1 g·L-1浓度70% 甲基硫菌灵，对番茄灰霉病菌、小麦纹枯病菌的防抑制作用高于1 g·L-1浓度80% 多菌灵。

图6 不同发酵条件菌株 A-m1发酵滤液抑菌活性Fig.6 Antibacterial activity of strain A-m1 under different fermentation conditions

图7 菌株 A-m1 发酵滤液对 9 种植物病原菌平板对峙Fig.7 The antagonism of the strain A-m1 fermentation broth to 9 plant diseasesA.葡萄座腔菌B. dothidea； B.胶孢炭疽菌C. gloeosporioides； C.苹果拟茎点霉P. mali； D.番茄灰霉病菌 B. cinerea； E.南天竹炭疽病菌C. karstii； F.君子兰茎基腐病菌F. oxysporum； G.小麦赤霉病菌F. graminearum； H.小麦纹枯病菌R. cerealis； I.小麦全蚀病菌 G. graminis. 每幅图左培养皿为空白平板对照，有培养皿为添加有发酵滤液平板。 Each petri dish on the left is a blank plate control, and the right petri dish is a plate with a fermentation filtrate added.

表2 菌株A-m1发酵滤液和2种农药对9种植物病原菌抑制作用Tab.2 Inhibition effect of strain A-m1 fermentation broth and two pesticides on 9 plant diseases

3 讨论

关于娄彻氏链霉菌在植物病害生防上已有一些研究，如：菌株Lj20是从山西临汾辣椒根部分离的内生菌 (马林等，2008)，其抗真菌代谢产物是2，6-二叔丁基对甲酚和3，5-二叔丁基-4-羟基-苯甲醚；娄彻氏链霉菌ACTA1551(Kaninietal., 2013)是分离自希腊的一株内生菌，可防治尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起的番茄枯萎病，同时还能促进植株的生长；菌株TRM42561从新疆盐环境中分离得到 (柳成宾等，2014)，室内对棉花黄萎病菌(Verticilliumdahliae)菌丝生长抑制率为 83.75%，孢子萌发抑制率为 68.75%，田间防治效果达到 41.65%；娄彻氏链霉菌菌株ZZ-9出甘肃陇东苹果根际土壤中分离得到 (薛应钰等，2016)，对苹果树腐烂病菌Cytosporasp.生长抑制率可达96%。 但以上研究中并未提及发酵液产生色素的现象，本研究中分离得到的娄彻氏链霉菌 A-m1在抑菌作用高的时候，发酵液呈现出黄色。A-m1发酵液高抑菌活性与其色素产生同步的现象是本研究初次报道，该现象可能是菌株A-m1特有性状。菌株A-m1在多种固体培养基中也有色素产生，但不能使明胶液化，这与菌株Lj20(马林等， 2008)特征存在区别。这也说明不同地理条件下的娄彻氏链霉菌由于其生态适应性存在一定差别，其他未知的生物功能差别有待进一步研究。

葡萄座腔菌寄主范围广泛，除苹果外，还可危害杨树(Populus)等十多种树木(杨蕾等， 2015)。由葡萄座腔菌引起的苹果轮纹病，不仅造成枝干枯死，严重削弱树势，甚至可导致烂果，造成较大的经济损失，在我国各苹果产区都有发生，且近年来病情逐渐加重； 同时拟茎点霉菌和胶孢炭疽菌也危害苹果等果树的枝条和主干，造成枯枝和枯干，严重时甚至整株死亡(胡玉清等， 2016)。目前化学防治是苹果枝干病害最主要的方法，化学农药的长期使用，易造成环境污染，农药残留超标，威胁人类健康，甚至导致病原菌产生抗药性(李晓军等， 2009； 杨炜华等， 2002)。本试验中菌株A-m1发酵滤液5 mL对葡萄座腔菌抑菌率超过95%，超过1 g·L-1的多菌灵产生的作用效果，A-m1发酵滤液对胶孢炭疽菌的抑菌率为83.08%±1.38%，对苹果拟茎点霉的抑菌率为91.04%±1.55%，对3种苹果枝干病原均表现出良好的抑菌活性。薛应钰等(2016) 报道了娄彻氏链霉菌菌株ZZ-9对壳囊孢Cytosporasp.的抑制作用，但引起苹果树腐烂病菌的病原种类有多种，ZZ-9对本研究中选择的3种苹果枝干病害病原的活性尚不明确。笔者还采用了接种试验评价菌株A-m1的致病性，结果表明其对苹果枝干不具有致病性(李永丽等， 2020)，该菌株来源于新疆野苹果内生菌，理论上也能生存于苹果树体内，将A-m1用于苹果树病害生防是否长期发挥防效有待进一步验证。

在对3种苹果枝干病原表现出抑菌活性之外，本研究还选择了园林植物、蔬菜、和粮食作物上的几种病原开展了抑菌试验。番茄灰霉病是蔬菜重要病害，多年来一直依赖化学药剂防治，对多种农药都产生了抗药性(纪明山等， 2003)。对番茄灰霉病菌的生长抑制试验中，A-m1发酵滤液抑菌作用高于甲基硫菌灵和多菌灵。A-m1发酵滤液对参试的园林植物、蔬菜、和粮食作物的部分病原均表现出抑菌作用，菌株 A-m1抑菌具有广谱性，抑菌活性明显，具有对多种植物病害进行生物防治的应用潜力。

链霉菌防治植物病害的作用机制主要有3种： 抗生作用、竞争作用和寄生作用，其中最主要的是抗生作用。在本研究中用到了A-m1发酵滤液，对多种病原表现出抑菌活性，说明A-m1产生了抗生物质； 但其抗生物质是否是一种或多种物质，其含量也不清楚，有必要对抑菌物质开展萃取和分离进一步研究，有可能为开发新型抑菌化合物提供参考。Abbasi等(2019) 用娄彻氏链霉菌Y28菌株处理番茄后能诱导植物中过氧化氢酶和过氧化物酶活性的增加，从而诱导出对镰刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.lycopersici)3菌株特异性的系统抗性。本研究使用的A-m1菌株是否能引起相关植物的系统抗病性，还有待进一步试验研究。

4 结论

本研究从新疆野苹果枝干中分离得到1株内生具生防作用的娄彻氏链霉菌S.rocheiA-m1，中国典型培养物保藏中心保藏号为CCTCC M 2019266。高抑菌发酵条件最适基础培养基为高氏一号，最佳碳源为可溶性淀粉，最佳氮源为硝酸钾； 发酵起始种子液接种量4%，在23～32 ℃、pH6～8之间、装液量100/500 mL和发酵培养 4 天为较优的发酵条件。发酵滤液对供试的3种苹果枝干病害和6种其他植物病原菌均表现出很强的抑菌活性，具抑菌广谱性。S.rocheiA-m1 抑菌谱较广、抑菌活性高，具有防治部分作物真菌性病害的应用潜力。