长柄双花木种群遗传结构及种群历史*

孟艺宏 徐刚标 卢孟柱,2 姜小龙,3 郭飞龙

(1. 中南林业科技大学林木遗传育种实验室 长沙 410004； 2. 浙江农林大学 杭州311300； 3. 中国科学院上海辰山植物园 上海 201602)

遗传多样性是生物长期进化的产物。探讨生物种群进化历史，是理解历史环境因子和人为因素对现实种群地理分布格局、丰富度及进化潜力影响的理论基础(Cabreraetal., 2017)。我国亚热带山区多数原始森林植被是由暖温带落叶阔叶林和常绿阔叶林组成，是北半球温带植物区系中物种多样性和特有性程度最高的地区，分布18 000余种种子植物，其中50%～60%为特有种(Wangetal., 2015)，为中国-日本植物区系的核心部分，被认为是古老的植物演化谱系在第四纪冰期的重要避难所，成为全球生物多样性热点地区之一(叶俊伟等， 2017)。基于化石孢粉数据重建的植被分布模式(Yuetal., 2000; Nietal., 2010)表明，我国亚热带植物在末次冰盛期明显向南退缩，冰期后从避难所内原地(insitu)周边经历局部扩张，在冰期/间冰期的气候波动过程中，大多数植物可能选择在多地避难所幸存下来。随着分子种群遗传学理论和技术的发展，利用现实种群的遗传信息推测种群进化历史、多样性起源、分布和维持的潜在机制成为可能(Beaumontetal., 2004)。

长柄双花木(Disanthuscercidifoliusvar.longipes)(2n=16) 系金缕梅科(Hamamelidaceae)双花木属(Disanthus)植物(潘开玉等，1994)，为我国特有的第三纪孑遗植物，残存于南岭山脉、罗霄山脉及武夷山脉海拔1 300 m以下的常绿阔叶林和针阔叶混交林或矮林中。该物种对生境条件要求苛刻，适宜在温暖湿润气候和酸性土壤上生长，分布区狭窄，种群数量少，已被列为我国Ⅱ级保护植物和珍稀濒危植物(高浦新等， 2013； 孟艺宏等， 2019)。长柄双花木为多年生的落叶灌木或小乔木，树高2～3 m(溪谷两侧的植株可达7 m)，丛生。头状花序上对生2朵无梗的两性花，花序柄细长。自交亲和，以昆虫和风传播花粉，“花多果少”，种子主要依靠风力传播(肖宜安等， 2004)。心型叶，互生，叶色由初春绿色变为深秋紫红色，花、果红色，观赏价值高，极具有园林绿化市场的开发利用潜力(廖飞勇， 2010)。作为双花木属中国-日本植物区系的替代种，该物种在研究金缕梅科系统发育和东亚植物区系地理演化等方面具有重要的科学价值(高浦新等， 2013)，是探讨第四纪冰期以来我国亚热带地区植物分布格局及种群遗传结构时空变化机制的模式植物之一。

有关长柄双花木种群遗传学研究较少。现有的研究报道，由于样本采集于不同的局部区域以及采用不同的标记系统，存在着差异性结论。肖宜安等(2003)基于同工酶标记开展罗霄山脉井冈山地区5个种群遗传多样性研究，发现种群遗传多样性较高，种群遗传分化较小； 谢国文等(2014)采用ISSR标记分析南岭山脉5个种群遗传多样性的结果显示，种群遗传多样性偏低，种群间遗传差异不大； Yu等(2014)采用AFLP标记分析8个种群遗传多样性的结果表明，种群维持较丰富的遗传多样性，种群遗传分化明显。鉴于此，本研究基于荧光SSR标记技术，采集长柄双花木全分布区12个代表性自然种群，分析其种群遗传多样性和遗传结构，探讨现实种群遗传结构的历史成因，旨在为该物种遗传资源保护与开发利用策略的制定提供理论基础，也为理解我国亚热带地区植物多样性的起源和维持机制提供新证据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2017—2018年，参考文献(高浦新等， 2013)和各地植被本底调查资料，选择12个长柄双花木自然种群(表1)，采集嫩叶开展遗传多样性研究。为避免采样个体亲缘关系近，尽可能选取同龄级植株(株高3 m左右)，样株间距20 m以上(徐刚标， 2016)，共采集261个植株的叶片样本。采集的嫩叶立即放入装有硅胶的自封袋中，GPS定位采样点的经纬度和海拔，记录种群大小及采集的样本数。叶片样本带回实验室，倒出硅胶后密封，放入-4 ℃冰柜中保存备用。

表1 长柄双花木采样信息、样本量及种群遗传多样性参数①Tab.1 Sampling information, sample size and population genetic diversity of D. cercidifolius var. longipes

根据Gao等(2009)和孟艺宏等(2018)开发的长柄双花木特异SSR引物序列信息，筛选出15对能获得多态性扩增产物的SSR 引物(表2)。引物由上海Sangon公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取、TP-M13-SSR扩增及基因分型 采用孟艺宏等(2018)改良的CTAB法提取叶片DNA，TP-M13-SSR扩增技术进行荧光PCR扩增，毛细管自动荧光电泳系统ABI 3730XL对扩增产物进行检测。TP-M13-SSR扩增反应体系与程序，同孟艺宏等(2018)。

采用Gene Marker V4.0(http:∥www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/technical-resources/software-down loads.html)，判读PCR扩增片段的长度大小。1个峰，视为纯合子； 2个峰，视为杂合子。

1.2.2 遗传参数估算 采用FSTAT2.9.3(http:∥www.bio-soft.net/tree/FSTAT.html)，统计估算种群及位点上的等位基因数(NA)、有效等位基因数(NE)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)，以及种群私有等位基因丰富度(pAR)和种群内近交系数(FIS)(Weiretal., 1984)，并对各位点和种群进行Hardy-Weinberg平衡检测。

1.2.3 遗传结构分析 采用FSTAT2.9.3，估算成对种群间遗传分化系数(FST)(Weiretal., 1984)。

采用STRUCTURE 2.3(http:∥pritch.bsd. ushicago.edu/structure.html)，对所有参试个体进行Bayesian聚类分析。基于种群间等位基因频率相互独立(independent allele frequencies)的假设，采用独立等位基因频率混合模型(admixture model)，设定类群数(K)为1～12(参试种群数)，Length of Burn-in Period和MCMC均为10 000，每个K值运行12次。根据独立运行每个K值所获得的后验概率lnP(D)，计算ΔK值。ΔK最大值对应的K值视为最合理的类群数(Evannoetal., 2005)。用STRUCTURE 2.3分析参试个体归属各类群的比率(Q>0.6)，确定个体归属的类群。

采用ARLEQUIN 3.2(https:∥www.softpedia.com/get/Science-CAD/Arlequin.shtml) 中分子方差分析(AMOVA) 选项，估算种群间、种群内遗传方差分量，10 000次置换，评价统计显著性。

1.2.4 种群历史事件推测 采用Bottleneck1.2.02(http:∥www.montpellier.inra.fr/URLB/bottleneck/bottleneck. html)软件中Wilcoxon单侧检验法选项，选择双相突变模型(two-phased mutation model, TPM)，基于种群杂合度过剩概率，检测每个种群是否经历遗传瓶颈事件。10 000次置换，评价统计显著性。

2 结果与分析

2.1 长柄双花木种群遗传多样性

15对SSR引物对12个种群261株个体进行TP-M13-SSR扩增，共检测到129个等位基因。各位点上的等位基因数(NA)为4(DC111)～15(DC115)，平均值为8.6； 有效等位基因数(NE)介于2.00～6.79之间，平均值为3.5。各位点观测杂合度(HO)和期望杂合度(HE)变动幅度分别为0.11～0.63和0.50～0.85，平均值分别为0.37和0.67(表2)。这表明，各SSR引物检测出的位点多态性较高，长柄双花木种内遗传变异较丰富。Hardy-Weinberg平衡检验的结果显示，所有位点都极显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.001)。

种群遗传参数的统计分析结果(表1)表明，种群中的等位基因数(NA)变异幅度为2.7～4.1，平均值为3.4； 有效等位基因数(NE)为1.74～2.50，平均值为2.1。种群观测杂合度(HO)均小于期望杂合度(HE)，平均值分别为0.35和0.43。各种群中均有私有等位基因，平均值为0.15，但私有等位基因丰富度(pAR)差异较大(0.06～0.25)。这表明种群遗传多样性较丰富。所有参试种群中，井冈山种群(JGS)的各项遗传参数最大，遗传多样性最高，其次为玉山种群(YS)； 湖南莽山种群(MS)除观察杂合度(HO)外，其他各项遗传参数最小，遗传多样性最低。平均种群内近交系数(FIS)为0.19，除湖南道县种群(DX)内近交系数为负值(-0.02)，并未显著偏离Hardy-Weinberg平衡以外，其他种群内近交系数均为正值(0.10～0.40)，呈现出极显著的不平衡状况(P<0.001)。

2.2 长柄双花木种群遗传结构

FSTAT2.9.3估算的成对种群间遗传分化系数(FST)见表3。FST为0.169(YS与KH)～0.514(LQ与MS)，平均值为0.354。这表明，在整体上，种群间遗传分化程度较高。

表3 长柄双花木成对种群FST的估算值Tab.3 The estimates of pairwise FST for D. cercidifolius var. longipes

基于Bayesian聚类的STRUCTURE 2.2软件分析的结果显示，当K=2时，对应的△K值最大，表明长柄双花木12个种群261株个体的最合理聚类组数为2。K=2情况下，根据每株个体归属于各类群的比值(Q)，绘制参试的植株个体归属2个类群的比例图(图1)。由图1可知，龙泉(LQ)、开化(KH)、玉山(YS)和井冈山(JGS)种群聚为类群Ⅰ(红色)，道县(DX)、莽山(MS)、宜章(YZ)、连州(LZ)、邵阳(SY)、新宁(XN)、宜黄(YH) 和宜丰(YF)种群聚为类群II(绿色)。除宜章(YZ)(4株)、井冈山(JGS)(2株)、邵阳(SY)(2株)、宜黄(YH)(1株)种群中的少数个体(占比3.4%)归属于不同类群的Q值小于0.6外，大多数(96.6%)植株个体的谱系清晰。

AMOVA分析结果(表4)表明，长柄双花木种群内变异分量占总变异的59.67%，种群间遗传变异占总变异的40.33%，种群间遗传差异极显著(P<0.001)。

图1 STURCTURE分析结果的直方图(K=2)Fig.1 Histogram of the STRUCTURE analysis for the model with K=2

表4 长柄双花木种群分子方差分析Tab.4 The molecular variance analysis of populations of D. cercidifolius var. longipes

2.3 长柄双花木种群历史

基于双相突变模型检测长柄双花木参试种群近期进化历史上是否经历遗传瓶颈效应的结果(表5)显示，12个种群均未出现杂合子过剩现象(P>0.05)，所有种群中的等位基因分布模式为正常L型分布(normal L-shaped distribution)，不符合漂移模型(shifted mode)，表明长柄双花木种群未经历遗传瓶颈事件。

表5 长柄双花木种群遗传瓶颈效应检测①Tab.5 Bottleneck detection for D. cercidifolius var. longipes

3 讨论

3.1 长柄双花木自然种群的遗传多样性

我国南方地区山脉走向多变，地形复杂，物种多样性和特有性程度高，是人类活动较频繁的经济地理区域，自然生境碎片化较为严重(Zhaoetal., 2012)。本研究表明，该区域特有物种长柄双花木维持较高水平的遗传变异(表1、表2)，与前人的研究结论(肖宜安等， 2003； Yuetal., 2014)一致，也与基于SSR标记分析我国南方同科植物檵木(Loropetalumchinense)(Yuanetal., 2015)的结果相类似。这表明，近期生境碎片化和遗传漂变并未对其种群遗传多样性产生严重影响(Zhaoetal., 2012; Yuanetal., 2015)。

大量研究表明，一些珍稀、特有物种维持较高遗传多样性(Geetal., 2003; Zhaoetal., 2012； Turchettoetal., 2016; Soaresetal., 2018)。遗传多样性高低与物种的演化历史、冰期避难所种群的遗传多样性维持、分布区的地域特征、物种的生态习性及交配系统等诸多因素有关(Xiaoetal., 2015; Turchettoetal., 2016; Soaresetal., 2018)。长柄双花木维持较高遗传多样性，可能与该物种起源古老、第四纪冰期种群结构相对稳定、现实种群为其避难所残迹有关(Geetal., 2003; Behlingetal., 2007; Yuetal., 2014)。

本研究中，所有位点都偏离Hardy-Weinberg平衡(表2)。绝大多数(91.7%)种群内近交系数为正值，呈现出极显著的不平衡状况，表现为杂合子缺失(表1)，揭示出种群内普遍存在自交或近交(王雁红等， 2015； Turchettoetal., 2016)，这符合长柄双花木植株丛生、自交亲和的生物学特性。

3.2 长柄双花木种群遗传结构和遗传分化

长柄双花木遗传变异主要存在于种群内(59.67%，表4)，与Yu等(2014)的研究结论基本一致。分子方差分析结果中的种群间变异组分(40.33%)与估算的成对种群遗传分化系数平均值(0.354)相差不大，种群间遗传分化程度较高。但是，与肖宜安等(2003)和谢国文等(2014)研究得出的种群间遗传差异较小的结论相反。这可能与前人采集的样本材料来源于局部区域有关。

植物种群遗传分化程度受其交配系统、生活史、分布类型、花粉/种子传播方式及分布范围、隔离程度及进化历史等诸多因素影响。长柄双花木的繁育系统为混合交配系统，小粒种子依靠风力传播(肖宜安等， 2003)，但种群遗传分化系数高于基于SSR标记揭示的混合交配系统(0.26)、种子依靠风力传播(0.13)、特有(0.26)、窄域分布(0.23)的植物种群遗传分化系数的统计平均值(Nybom， 2004)。这可能与该物种对生境要求特殊以及分布区的地形地貌特征有关。长柄双花木间断分布于南岭山脉、罗霄山脉及武夷山脉，多在空气湿度大的沟谷、溪流两旁生长，种群间被走向多样的高山阻隔。

STRUCTURE分析结果(图1)表明，长柄双花木自然种群被聚为2个不同类群，个体谱系清晰，与Yu等(2014) 基于AFLP标记技术的研究结果(南岭类群和华东类群)基本吻合。

3.3 长柄双花木种群的历史事件

更新世期间，我国亚热带地区的气候温和(Juetal., 2007)，长柄双花木可能广泛分布于该地理区域。末次盛冰期(约2.2万年前)，该地区气温比当前低 4～6 ℃，明显变干(Qiuetal., 2011)，但南岭山脉、武夷山脉的气候波动较小(Fengetal., 2016)，可能为该物种生存提供了较适宜的生境条件，成为其避难所。

末次盛冰期以来，长柄双花木的潜在分布区收缩(孟艺宏等， 2019)，历史种群中的等位基因分布模型为正常L型分布，没有经历遗传瓶颈事件(表5)，这表明该物种可能遭受末次盛冰期的气候影响较小。长柄双花木种群进化历史过程不符合基于化石孢粉证据揭示的第四纪冰期亚热带植物“收缩-扩张”模型(即冰期向低纬度迁移至避难所，间冰期及冰期后向高纬度扩张)(Yuetal., 2000; Nietal., 2010)。这与分布于我国南方的白菊木(Leucomerisdecora) (Zhaoetal., 2012)、甜槠(Castanopsiseyrei)(Shietal., 2014)、三叶崖爬藤(Tetrastigmahemsleyanum)(Wangetal., 2015)、檵木(Gongetal., 2016)的种群历史过程相类似。Zhao等(2012)认为，复杂的地形特点，可能会引起植物种群间诸多的地理隔离因素产生，在间冰期种群间仍然保持隔离。自然地理屏障隔离，以及气候变迁和人类经济活动造成的生境碎片化，导致种群间遗传分化加剧，种群规模缩小甚至部分种群趋向灭绝，是长柄双花木现代地理分布格局和种群遗传结构的主要成因。

3.4 长柄双花木遗传资源保护

长柄双花木种群间遗传分化较大(表3、表4)，种群中私有基因较丰富(表1)。因此，保护种群遗传多样性，是防止该物种特异种质流失的关键，也对维持种群遗传结构十分重要。目前，该物种的大多数种群分布于自然保护区内，自然生境得到了有效保护，但种群中的幼苗过少，为负增长型结构(缪绅裕等， 2014)。如何采取有效的营林措施促进其种群的自然更新能力，将是今后研究的重点。前期采样发现，邵阳种群(SY)分布地已被当地政府规划为旅游区，而新宁种群(XN)的周边为农田，人为干扰破坏极为严重。因此，分布于自然保护区外的种群，建立自然保护小区的工作已显得迫在眉睫。相对于其他种群，井冈山种群(JGS)和宜丰种群(YF)的遗传多样性最为丰富(表1)，应重点开展这2个种群的生境监测和种群生殖生物学特性研究，评估生境碎片化对小尺度种群空间遗传结构、交配系统的影响。加强长柄双花木的繁殖生物学特性和人工辅助授粉技术研究，突破其“花多果少”的繁殖瓶颈，对该物种自然种群恢复与重建、人工迁地保育和资源开发利用都尤为重要。

4 结论

近期生境碎片化和遗传漂移对长柄双花木种群遗传多样性影响较小。长柄双花木在物种和种群水平上，维持较丰富的遗传变异，具有较高的进化潜力。种群间的自然屏障，以及气候变迁和人类干扰导致的种群生境碎片化，是其现代地理分布格局和种群遗传结构的主要成因。本研究从物种水平上较全面地揭示了长柄双花木种群遗传多样性及遗传结构特征，可为该物种遗传资源保护策略的制定提供科学依据。