硫化氢对尿源性脓毒血症肾细胞凋亡的影响及其机制

邹 雄，陈 仙，唐亚纯，王斌辉，廖国涛，许武军

0 引 言

尿源性脓毒血症指由于泌尿系统感染而引起的脓毒血症[1]。急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是脓毒血症的严重并发症[2]，其特点是病死率高且肾功能恢复差，并发肾损伤的脓毒血症患者较单纯脓毒血症患者的预后明显变差[3-4]。有学者发现内毒素能够促进细胞凋亡的发生[5]。Girardot等[6]研究证明脓毒血症时，肾的损害和肾组织细胞凋亡有直接的关系。

硫化氢(H2S)作为近年来继NO、CO之后发现的第3种气体信号分子[7]，其具有广泛的生物学作用，对肾[8]、神经[9]、心脏[10-11]都具有一定的保护作用。本研究将探索H2S能否调控p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)、半胱氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic acid specific protease，Caspase3)的表达来影响肾组织细胞凋亡从而减轻脓毒血症肾损害。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只健康雄性新西兰兔购自湖南太平生物科技有限公司，体重2.1～2.5 kg，一兔一笼，标准颗粒饲料及纯净水喂养，铁笼边放饲料槽及自由饮水管，湿度50%～60%，室温20～25 ℃。

1.2 主要试剂与药品及检测仪器大肠埃希菌(ATCC 25922南华大学附属第二医院检验科)，NaHS溶液、DL-炔丙基甘氨酸(DL-Propargylglycine，PAG)溶液、p38MAPK试剂盒、Caspase3试剂盒均买自武汉纯度生物有限公司，TUNEL凋亡试剂盒(上海生工)、光学显微镜(德国Leica)、荧光显微镜(上海万衡)、分光光度计(INESA)、血细胞分析仪(库贝尔)、生化分析仪(西门子)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组采用随机数字表法将40只新西兰兔分成5组，每组8只。对照组：给予饲料以及纯净水喂养；假手术组：腹腔内注射10%的水合氯醛(4 mL/kg)进行麻醉，取左肋缘最低点作切口(3 cm)，在后腹腔找到左肾及输尿管，游离输尿管上段，依次缝合切口，术后正常喂养；脓毒血症组：在假手术组的基础上，用1号丝线结扎输尿管远端，向输尿管近端注入108/mL大肠埃希菌菌液(0.4 mL/kg)，制作脓毒血症模型，依次缝合切口，术后正常喂养；NaHS组：手术方式及步骤与脓毒血症组相同，缝合切口后按8.4 μmol/kg经耳缘静脉注射浓度为50 mmol/L的NaHS溶液,促进H2S产生；D-L炔丙基甘氨酸组(DL-Propargylglycine，PAG)组：手术方式及步骤与脓毒血症组相同，缝合切口后按37.5 mg/kg经腹腔注射浓度为50 mmol/L的PAG溶液,抑制H2S产生。

1.3.2 检测指标生命体征：分别记录术前、术后24 h、48 h、72 h时间点5组新西兰兔的肛温、呼吸频率、心率。血液相关指标：分别在术前、术后24 h、48 h、72 h时间点采取5组新西兰兔的耳中动脉血，用全自动血液细胞分析仪测血常规白细胞计数以及中性粒细胞计数；全自动生化分析仪测其肌酐、尿素氮。

1.3.3 兔肾组织的HE染色法术后72 h取左肾组织进行石蜡包埋切片后，采用罗氏全自动HE染色仪对各组兔肾组织进行HE染色。

1.3.4 术后72 h ELISA法检测肾组织p38MAPK、Caspase3的含量严格按照兔p38MAPK、Caspase3定量酶联免疫测定试剂盒的说明书操作，实验结束后在450 nm波长依序测量各孔的吸光度(A值)。分别以各自标准物的浓度作为Y轴，与之对应的A值作为X轴，用Excel表计算出标准曲线的直线回归方程式，样品的A值代入方程，计算出相应的数值再乘以5得出待测样品的浓度值。

1.3.5 TUNEL法检测兔肾组织细胞凋亡情况步骤严格参照上海生工公司TUNEL染色试剂盒进行；TUNEL染色后进行DAPI复染，待DAPI染液凝固后，随机选择5个视野，在荧光显微镜下综合DAPI染色和TUNEL染色计算高倍视野下(×400)黄绿色凋亡细胞占总的细胞比值。

2 结 果

2.1 新西兰兔肛温、呼吸频率以及心率的比较假手术组术后24 h肛温、呼吸频率、心率较对照组明显升高(P<0.05)。脓毒血症组、NaHS组术后24 h、48 h、72 h的肛温、呼吸频率、心率较对照组、假手术组明显升高(P<0.05)。NaHS组术后24 h、48 h、72 h的肛温、呼吸频率、心率较脓毒血症组和PAG组明显降低(P<0.05)。PAG组术后24 h、48 h、72 h的肛温、呼吸频率、心率较其余4组明显升高(P<0.05)。见表1。

2.2 新西兰兔血白细胞计数和中性粒细胞计数比较假手术组术后24 h白细胞、中性粒细胞较较对照组升高(P<0.05)。脓毒血症组术后24 h、48 h、72 h的白细胞、中性粒细胞较对照组和假手术组升高(P<0.05)。NaHS组术后24 h、48 h、72 h的白细胞、中性粒细胞较脓毒血症组和PAG组降低(P<0.05)。PAG组术后24 h、48 h、72 h的白细胞、中性粒细胞较同时间点其余4组升高(P<0.05)。见表2。

2.3 新西兰兔肾功能的比较脓毒血症组、NaHS组、PAG组术后24 h、48 h、72 h肌酐、尿素氮较对照组和假手术组明显升高(P<0.05)。NaHS组术后24 h、48 h、72 h肌酐、尿素氮较脓毒血症组和PAG组明显降低(P<0.05)。PAG组术后24 h、48 h、72 h肌酐、尿素氮较同时间点脓毒血症组和NaHS组明显升高(P<0.05)。见表3。

表 1 新西兰兔肛温、呼吸频率以及心率的比较

表 2 新西兰兔血白细胞计数和中性粒细胞计数的比较

表 3 新西兰兔肾功能的比较

2.4光学显微镜观察HE染色肾组织病理变化对照组与假手术组的肾组织形态结构未见明显异常；脓毒血症组肾小球明显萎缩，囊腔明显扩大，肾小管水肿明显，可见坏死组织在肾小管管腔内残留，肾间质中可见炎性细胞浸润；NaHS组病理损害较脓毒血症组明显减轻；PAG组病理损害较脓毒血症组和NaHS组明显增强，且可见肾小球结构被破坏，无法分辨肾小囊囊腔。见图1。

2.5 TUNEL法检测兔肾组织细胞凋亡情况对照组和假手术组兔肾组织凋亡细胞散在分布，2组的凋亡指数比较差异无统计学意义(P>0.05)；脓毒血症组肾组织凋亡细胞明显集中成团，凋亡细胞布满整个视野，肾组织细胞凋亡指数明显高于对照组与假手术组(P<0.05)；NaHS组兔肾组织细胞凋亡指数较脓毒血症组明显减少(P<0.05)，较对照组和假手术组明显增多(P<0.05)，但NaHS组未见凋亡细胞明显成团；PAG组凋亡细胞较脓毒血症组更加集中存在，PAG组细胞凋亡指数较脓毒血症组和NaHS组明显升高(P<0.05)。见图2，表4。

a：对照组；b：假手术组；c：脓毒血症组；d：NaHS组；e：PAG组

图示NaHS组细胞凋亡较脓毒血症组、PAG组明显降低

2.6 ELISA法检测兔肾组织中p38MAPK、Caspase3蛋白的含量脓毒血症组、PAG组肾组织中p38MAPK、Caspase3蛋白的表达量较对照组、假手术组、NaHS组明显升高(P<0.05)。PAG组术后肾组织中p38MAPK、Caspase3蛋白的表达量较脓毒血症组明显升高(P<0.05)。见表4。

表 4 新西兰兔肾组织中p38MAPK、Caspase3蛋白的表达量

3 讨 论

本研究中，假手术组术后24 h的肛温、呼吸频率、心率、白细胞、中性粒细胞较对照组升高，而术后48 h、72 h的肛温、呼吸频率、心率、白细胞、中性粒细胞与对照组比较差异无统计学意义。考虑原因为肛温、呼吸频率、心率、白细胞、中性粒细胞的变化较肌酐、尿素氮灵敏；由于手术应激引起假手术组术后24 h肛温、呼吸频率、心率、白细胞、中性粒细胞的值较对照组升高，但由于解除了手术刺激，且假手术组无脓毒血症的发生，术后48 h的肛温、呼吸频率、心率、白细胞、中性粒细胞又恢复正常；采用重复测量得出对照组、假手术组的各项指标比较并无明显差异，说明手术刺激对兔的各项指标并无明显影响。与对照组、假手术组比较，脓毒血症组术后48 h肛温、呼吸频率、心率、白细胞、中性粒细胞进一步升高，无缓解迹象，且肾功能进一步损害，肌酐、尿素氮升高，综合这些指标以及一般情况，考虑尿源性脓毒血症新西兰兔模型建造成功；脓毒血症组术后72h，精神状态极差，肛温、呼吸频率、心率以及炎症指标白细胞、中性粒细胞进一步升高和肾功能情况进一步恶化，且处死新西兰兔后，发现其肾色泽暗淡，体积较正常肾明显增大，且肾组织HE染色后高倍镜下观察，出现典型脓毒血症AKI的病理改变。NaHS组术后各项指标较脓毒血症组明显改善，PAG组术后各项指标较脓毒血症组和NaHS组进一步恶化。因此考虑H2S对尿源性脓毒血症新西兰兔的一般情况、生命体征(肛温、呼吸频率、心率)、肾功能(肌酐、尿素氮)均有一定的改善作用。该结果与本研究前期的实验结果[12-13]基本一致。

细胞凋亡的过表达与多种蛋白表达增加相关，而p38MAPK、Caspase3是与细胞凋亡密切相关的两种蛋白。p38MAPK信号通路在缺氧、应激以及内毒素和炎症因子存在的条件下可以被激活[14]，它与细胞的凋亡相关，且近年来被证实参与了肾组织细胞凋亡[15]，Zhou等[16]的研究进一步证明p38MAPK的活化在脓毒症过程中对细胞凋亡有促进作用。Caspase3是哺乳动物凋亡途径的重要执行者之一，在细胞凋亡中发挥着举足轻重的作用；研究表明，Caspase3的活化导致心肌细胞[17]、前列腺癌细胞[18]凋亡的增加，而抑制Caspase3的活性减少肝细胞以及肾组织细胞凋亡的发生[19]。本研究中，对照组和假手术组术后72h兔肾组织中p38MAPK、Caspase3的表达较低，2组间p38MAPK、Caspase3表达量差异无统计学意义；脓毒血症组、NaHS组、PAG组3组兔肾组织中p38MAPK、Caspase3的表达量均显著高于对照组、假手术组，说明脓毒血症的发生会导致p38MAPK、Caspase3过度表达，这与Brent等[20]的研究报道一致；感染尿源性脓毒血症的新西兰兔注入NaHS，增加H2S生成后p38MAPK、Caspase3明显减少，肾组织细胞凋亡减少，而注射PAG溶液抑制H2S的产生后，p38MAPK、Caspase3表达增加，肾组织细胞凋亡明显增加，肾组织中p38MAPK、Caspase3的表达量和肾组织细胞凋亡成正相关，表明H2S可能通过抑制p38MAPK、Caspase3的表达来减少肾组织细胞凋亡。

综上所述，本研究结果显示H2S对尿源性脓毒血症兔的肾功能具有一定的保护作用，其机制可能与H2S抑制尿源性脓毒血症肾组织中p38MAPK、Caspase3的表达从而减少肾细胞凋亡有关。