腹腔镜与开腹结直肠癌根治术对循环血癌胚抗原mRNA含量影响的对比研究

陈鸿源， 薛芳沁， 谢礼锋， 许 超， 王襄瑜， 黄良祥

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)为自发或因诊疗操作由实体肿瘤或其转移灶释放而进入外周血循环的游离肿瘤细胞，大部分被机体免疫系统吞噬，少部分可通过迁移、黏附、聚集形成微小癌栓，最终可能发展为转移灶，是术后肿瘤复发、转移的重要原因[1]。目前，外科手术仍然是治疗无远处转移结直肠癌患者的主要手段。近年来，随着腔镜器械的发展及微创治疗理念的深入，腹腔镜已被广泛应用于结直肠癌手术中[2, 3]。关于腹腔镜结直肠癌根治术与传统开腹手术对CTC的影响有无差异目前尚不明确。癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)mRNA是胃肠道肿瘤特异性标志基因，在结直肠癌细胞中高度表达，而在正常的血细胞中不表达，并且RNA在细胞外环境中非常不稳定、容易降解，因此，在血细胞中检测到CEA mRNA可提示CTC的存在[4]。本研究采用实时荧光定量PCR技术检测60例结直肠癌患者手术前后外周及肠系膜下静脉血中CEA mRNA的表达情况，探讨腹腔镜与开腹两种手术方式对CTC的影响有无差别。

1 对象与方法

1.1对象 本研究为前瞻性研究，收集2018年1—8月诊治的结直肠癌患者60例，男性40例，女性20例，年龄(59.53±12.83)岁(18～80岁)。纳入标准：(1)术前肠镜及病理诊断为降结肠癌、乙状结肠癌或高位直肠癌；(2)术前T分期为T2～T4a；(3)心肺功能情况可，术前ASA评分为1～3分。排除标准：(1)肿瘤侵犯周围脏官或发生远处转移；(2)仅行姑息性切除；(3)结直肠多发原发癌；(4)肿瘤直径<1 cm或>6 cm；(5)既往有内镜下肿瘤切除史；(6)术前接受过放化疗。剔除标准：(1)术中因病情改变术式，如腹腔镜中转开腹；(2)血标本受污染或出现溶血、血液凝固。本研究符合伦理学标准并经医院伦理委员会讨论通过，患者家属均签署知情同意书。

将患者随机分为开腹组和腹腔镜组，每组30例。两组患者的性别、年龄、体质量指数(body mass index,BMI)、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤肉眼类型、肿瘤分化程度及肿瘤分期均相当，具有均衡可比性(表1)。肿瘤分期依据第八版AJCC结直肠癌TNM分期系统[5]。两组患者分别行开腹或腹腔镜结直肠癌D3根治术。

表1 腹腔镜组与开腹组结直肠癌患者的临床及病理情况

1.2方法

1.2.1试剂与仪器 通用型RT-PCR试剂盒(CW0742, 北京康为世纪生物有限公司)，逆转录试剂盒(RR047A, 日本Takara公司)，淋巴细胞分离液(LTS1077, 天津灏洋生物制品科技有限公司)，PE-5700荧光定量PCR仪(ViiATM7, 美国ABI公司)，普通PCR扩增仪(9600, 深圳黑马科技有限公司)，凝胶电泳成像分析仪(Cel DocxRs, 北京伯乐互联科技有限公司)，生物安全柜(HR1200-IIA2,青岛海尔特种电器有限公司)。CEA mRNA引物由上海铂尚公司设计，产物片段长度343 bp。

上游：5′-CTTTCGGGAGCGAACCTCAA-3′

下游：5′-GCTGTTGCAAATGCAGTCTTCC-3′

1.2.2样本收集及处理

1.2.2.1手术情况 两组患者根据组别分别进行腹腔镜或开腹结直肠癌D3根治性手术，手术均由同一组经验丰富的胃肠外科医师施行，手术均遵循肿瘤根治性原则。腹腔镜组手术时用CO2气体建立气腹，气流量1～2 L/min，压力维持在10～15 mmHg(1 mmHg=133.3 Pa)。

1.2.2.2样本的收集与保存 分别于手术开始前、手术结束时采集外周静脉(peripheral vein, PV)血5 mL；于肿瘤肠段游离前先予分离显露肠系膜下动、静脉, 然后采集肠系膜下静脉(inferior mesenteric vein, IMV)血5 mL；结扎肠系膜下动、静脉并游离肿瘤肠段，采集肿瘤标本中IMV血5 mL(采血时间点详见图1)。腹腔镜患者肿瘤游离前用头皮针经主操作孔Torcar采集IMV血(图2)。血液标本均用EDTA抗凝。用人淋巴细胞分离液将血样进行密度梯度离心，收集单核细胞，Trizol液重悬后置于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2.2.3总RNA抽提与逆转录 用RNA抽提试剂抽提单核细胞总RNA，然后用核酸蛋白分析仪检测各标本总RNA浓度和纯度。以提取的总RNA做为模板，采用逆转录试剂盒合成cDNA。逆转录反应体系为：25 ℃ 5 min→42 ℃ 60 min→70 ℃ 5 min终止。

1.2.2.4普通PCR与凝胶电泳 以逆转录获得的cDNA为模板，应用目的基因(CEA mRNA引物)、管家基因(GAPDH引物)和PCR试剂盒合成目的DNA片段。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析仪，分析两组患者术前及术后PV血、肿瘤游离前及游离后IMV血目的DNA片段的表达情况。若分别可见160及343 bp处两条亮带，说明无RNA降解，GAPDH和目的基因CEA mRNA均为阳性。若160 bp处有亮带显影，而343 bp处无亮带显影，说明GAPDH为阳性，无RNA降解，而目的基因CEA mRNA为阴性。若160 bp处无亮带显影，说明标本RNA已经降解，需剔除该病例(图3)。普通PCR反应体系为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s→60 ℃退火30 s→72 ℃延伸50 s，共36个循环，最后延伸10 min。

1.2.2.5实时荧光定量PCR 筛选出术前血细胞CEA mRNA阳性的血样，进一步行RT-PCR检测。取2 mL逆转录产物cDNA作为模板，管家基因GAPDH作为内参基因，应用CEA mRNA引物和RT-PCR试剂盒，通过PE-5700 RT-PCR仪进行检测。在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，选择在这个阶段进行定量分析。本实验设置的荧光阈值为0.02，当荧光信号增强到阈值时，待测血样单核细胞CEA mRNA扩增的循环次数分别被记录下来(即Ct值)。目的基因CEA mRNA的Ct值与管家基因GAPDH的Ct值之差即为目的基因相对扩增循环次数(即ΔCt值)。管家基因GAPDH在人群中稳定表达，目的基因CEA mRNA扩增的ΔCt值可用于提示其在细胞中的相对表达水平。本实验目的基因的扩增产物的溶解曲线均为单峰，峰型高耸，未见附加波形，扩增产物单一，无杂质(图4)。

2 结 果

2.1两组患者手术前后CEA mRNA阳性率情况

患者术后PV血CEA mRNA的阳性率为31.67%(19/60)，高于术前的21.67%(13/60)，但两者差别无统计学意义(P=0.215)；肿瘤游离后标本IMV血CEA mRNA的阳性率为53.33%(32/60)，明显高于肿瘤游离前的35.00%(21/60)，两者差别有统计学意义(P=0.043)。腹腔镜组与开腹组在术前及术后PV血、肿瘤游离前及肿瘤游离后IMV血的CEA mRNA阳性率分别进行比较，差别均无统计学意义(P>0.05，表2)。

表2 两组患者手术过程中循环细胞CEA mRNA阳性表达情况

2.2两组患者CEA mRNA阳性表达实时荧光定量PCR结果 腹腔镜组共7例患者术前PV血CEA mRNA阳性，其术后PV血CEA mRNA平均ΔCt值为(3.68±0.26)，小于术前的(4.79±0.85)，但两者差别无统计学意义(P=0.064)；肿瘤游离后标本IMV血CEA mRNA平均ΔCt值为(1.06±0.23)，明显小于游离前的(3.49±0.09)(P=0.012)。开腹组共6例患者术前PV血CEA mRNA阳性，其术后PV血CEA mRNA平均ΔCt值为(3.37±0.14)，小于术前的(5.03±0.75)，但两者差别无统计学意义(P=0.277)；肿瘤游离后标本IMV血细胞CEA mRNA平均ΔCt值为(0.86±0.37)，显著小于游离前的(3.37±0.30)(P=0.034)。两组患者术前PV血、肿瘤游离前IMV血、肿瘤游离后IMV血及术后PV血CEA mRNA的平均ΔCt分别比较，差别均无统计学意义(P>0.05，图5)。

3 讨 论

尽管近年结直肠癌的治疗取得较大的进展，但根治术后仍有30%～50%患者出现肿瘤复发或转移。研究表明，CTC在肿瘤的复发与转移过程中扮演着重要的角色[6-7]，因此对CTC进行检测评估及早期干预，对于降低肿瘤复发与转移有重要的意义。目前，CTC检测的方法有流式细胞术、免疫细胞化学、免疫磁珠分离检测法、PCR酶聚反应、CTC芯片等[8]。CTC在血液中的浓度极低，约109个血细胞或105～107个白细胞中仅含1个游离肿瘤细胞。PCR技术通过聚合酶链式反应对肿瘤细胞相关的转录标志物扩增后进行检测来证实肿瘤细胞的存在，具有较高的特异度和敏感度，更加适用于肿瘤根治术后CTC的检测[9]。CEA mRNA是胃肠道肿瘤特异性标志基因，在结直肠癌中高度表达,而非上皮细胞肿瘤及正常的血细胞中不表达,并且RNA在细胞外的环境中不稳定、容易降解，因此，血细胞内检测到CEA mRNA就可以提示CTC的存在[10]。综上，采用PCR技术检测血液中CEA mRNA的表达水平是检测结直肠癌CTC的一种有效方法。

在恶性肿瘤手术中，手术操作是否会增加肿瘤细胞血行转移的风险一直备受关注。国内外学者发现，CTC数量受手术干预的影响，术后CTC数量较术前升高，并与患者预后不佳有关[11-12]。Gazzaniga等的研究采用免疫磁珠技术检测结肠癌患者手术前后PV血CTC的阳性率，结果显示术后CTC的阳性率为60.50%，高于术前的37.20%[12]。Nagayasu等的研究采用PCR酶聚反应技术检测50例结直肠癌患者围手术期PV血CEA mRNA的阳性表达情况，发现术后CEA mRNA的阳性率为28.00%，高于术前的2.00%[13]。Park等的研究同样采用PCR酶聚反应技术检测42例结直肠癌患者术中IMV血CEA mRNA的阳性率，发现肿瘤分离后CEA mRNA的阳性率为52.40%，明显高于肿瘤分离前的23.80%[14]。本研究联合检测了围手术期PV血及IMV血CEA mRNA的阳性率，结果显示，术后PV血CEA mRNA的阳性率高于术前，肿瘤分离后IMV血CEA mRNA的阳性率显著高于肿瘤分离前(P=0.04)，表明手术操作过程中对肿瘤的触碰及挤压可能的引发肿瘤细胞进入血循环。因此，在肿瘤根治性手术中需注意“No-Touch”原则，应在处理肿瘤病灶前结扎离断肿瘤的引流血管及淋巴管，并在手术操作过程中尽可能减少对肿瘤的触碰与挤压。

近年来，随着腹腔镜器械的发展和手术技术的提高，腹腔镜结直肠癌根治术已在临床上广泛开展。与传统开腹手术相比，腹腔镜手术具有创伤小、恢复快、视野大、有利于精细解剖操作等优点，但也有一些不足之处，如操作技术相对较难掌握、手术时间相对较长、需建立CO2气腹及无组织直接触感等[3]。目前关于腹腔镜与开腹结直肠癌根治术两种手术方式对肿瘤细胞血循环转移(即CTC)的影响有无差异仍不明确。有学者担心腹腔镜手术中CO2气腹压可能会增加肿瘤细胞脱落与转移的风险。相关的动物实验研究表明，腹腔镜手术中CO2气腹不会增加肿瘤细胞转移[15-16]。Nagayasu等研究发现，腹腔镜与开腹结直肠癌根治术对PV血CEA mRNA的影响是相当的[13]。本研究结果提示，腹腔镜组与开腹组患者术前PV血、肿瘤游离前IMV血、肿瘤游离后IMV血、术后PV血CEA mRNA的阳性率比较差别均无统计学意义(P>0.05)。另外，笔者从肿瘤负荷量的角度再行评估，发现术前PV血、肿瘤游离前IMV血、肿瘤游离后IMV血及术后PV血细胞CEA mRNA扩增平均ΔCt值，腹腔镜组与开腹组各对应时间点比较，差别也均无统计学意义。由此可见，腹腔镜与开腹这两种手术方式对结直肠癌根治术中循环血CEA mRNA含量的影响无明显差异。

综上所述，外科手术操作有增加肿瘤细胞血循环转移的风险。但是，腹腔镜与开腹结直肠癌根治术这两种手术方式对循环血CEA mRNA的的影响无明显差异。在实施肿瘤根治性切除手术时，应严格遵循“No-Touch原则”，处理肿瘤病灶前优先结扎离断肿瘤的引流血管及淋巴管，并在手术操作过程中尽可能减少对肿瘤病灶的触碰与挤压。由于本研究样本量较少，可能存在有一定程度的偏倚，并且目前研究的时间较短，尚不能从生存率的角度进行分析。因此，本研究得出的结论可能有一定的局限性，后续需进一步扩大样本量从预后的角度进行研究。