青海亚麻籽总酚含量测定及其抗氧化活性研究

王兴瑞，陈昀昀，韩玉泽，李应霞，王进英,2

(1.青海大学 农牧学院，西宁 810016； 2.青海大学 三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁810016)

亚麻(LinumusitatissimumL.)是亚麻科、亚麻属的一年生草本植物，可分为纤维用亚麻、油用亚麻和油纤兼用亚麻3种类型。亚麻是世界十大油料作物之一，居世界油料总产量第7位[1]。亚麻是我国的重要经济作物，主要分布在西北和华北北部的干旱、半干旱高寒冷凉地区[2-3]。其中，青海亚麻种植历史悠久，青海特有的高原地理和气候特征使得青海亚麻成为了一种具有栽培价值的油料作物，在青海亚麻俗称胡麻[4]。

亚麻籽含脂肪30%～41%、纤维素20%～35%、蛋白质20%～30%、水分4%～8%、灰分3%～4%和单糖1%[5]。除此之外，亚麻籽中还含有一定的微量组分，包括生氰糖苷、植酸、酚类物质、胰蛋白酶抑制剂、谷酰胺脯氨酸、木脂素、矿物质、维生素等[6]。研究[7-8]发现，酚类化合物具有抗氧化、抗癌、抗炎等功效，能有效预防高血脂、高血糖、心脑血管疾病、肿瘤等慢性疾病。

亚麻籽中酚类物质的含量水平与基因或品种、收获时间、产地与环境有关[9]。目前国内对亚麻籽酚类物质组成及抗氧化活性研究主要集中在新疆、内蒙、山西及甘肃等主产区，而对青海亚麻籽的相关研究较少。因此，本文以山西、内蒙、甘肃产地的亚麻籽为对照，选择了青海贵德、互助、三合、民和4个不同地区的亚麻籽，利用超声辅助提取法提取总酚，福林酚法测定总酚含量，DPPH法测定其清除自由基的能力，以期为青海亚麻籽多酚的开发利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

4个青海贵德、互助、民和、三合产地的亚麻籽样品， 3个甘肃、山西、内蒙古产地的亚麻籽样品。

无水碳酸钠、没食子酸、福林酚试剂、95%乙醇、正丁烷、正己烷、氢氧化钠，盐酸、正丁醇、1, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)等，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

HHS-4S粉碎机；电子恒温不锈钢水浴锅；RE-52旋转蒸发仪；UV-1780紫外可见分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司；FA1004电子天平；DHG 9070A热风鼓风干燥箱；KQ-300E型台式机械超声波清洗器；PHSJ-4A pH计；DRG9070A热鼓风干燥箱；TGL20MW冷冻离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 总酚提取

将亚麻籽清洗，烘干12 h，粉碎，与正己烷按 1∶6 混合脱脂12 h，倒入离心管中，在3 000 r/min离心20 min，倒出上清液，沉淀在40℃下热风干燥，得到脱脂亚麻籽粉样品。准确称取脱脂亚麻籽粉样品3 g放入烧杯中，加入60%乙醇溶液，封口，在一定超声温度下超声一段时间，抽滤，收集提取液。取30 mL提取液放入烧杯中，加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，将提取液中NaOH浓度调至0.25 mol/L，反应2 h。反应结束后加入1 mol/L的盐酸调节pH为4.0。用0.45 μm醋酸纤维素膜过滤，滤液减压浓缩，加入30 mL 60%乙醇复溶，移至容量瓶中保存备用。

1.2.2 总酚含量测定

标准曲线绘制：精密称取没食子酸标准品0.020 0 g，用蒸馏水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得质量浓度为0.2 mg/mL的标准液。准确移取没食子酸标准液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL于玻璃管中，各加1 mL 1 mol/L福林酚试剂，涡旋混合1 min使其反应，再加入3 mL 10%Na2CO3溶液振摇，加蒸馏水至10 mL，于45℃水浴中反应1.5 h，以不加标准液的溶液为空白对照，在765 nm波长下测定吸光值，以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，建立没食子酸标准曲线。得到的标准曲线回归方程为y=6.575x+0.018 3，R2=0.998。

样品中总酚含量测定：取0.3 mL 1.2.1提取的总酚复溶溶液于10 mL玻璃管中，然后加入1 mL 1 mol/L福林酚试剂，涡旋混合1 min使其反应，再加入3 mL 10%Na2CO3溶液振摇，加蒸馏水至10 mL，于45℃水浴中反应1.5 h，以不加标准液的溶液为空白对照，在765 nm波长下测定吸光值。通过标准曲线计算样品中的总酚含量。

1.2.3 亚麻籽总酚DPPH·清除能力测定

取1 mg DPPH溶于24 mL 95%乙醇中，充分振摇均匀，避光保存备用。在10 mL玻璃管中加入3.0 mL DPPH溶液和1.0 mL 95%乙醇溶液，混匀，反应稳定后，以95%乙醇为参比，在517 nm处测吸光值(A0)；同法依次加入3.0 mL 95%乙醇溶液和1.0 mL样品溶液，测定吸光值(A2)；依次加入3.0 mL DPPH溶液和1.0 mL样品溶液，测定吸光值(A1)。DPPH·清除率按下式计算。

1.2.4 数据处理与分析

所有数据平行测定3次，结果取平均值，采用Microsoft Excel 2010软件对数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 亚麻籽总酚提取工艺优化

2.1.1 单因素实验

2.1.1.1 固液比对提取效果的影响

在超声时间20 min、超声温度40℃条件下，研究不同固液比对亚麻籽总酚提取的影响，结果见图1。

从图1可以看出，随固液比增大，总酚含量增大，在固液比1∶15时总酚含量最高，此后随固液比继续增大总酚含量下降。此趋势与孙伟洁[10]的研究结果一致。主要原因可能是乙醇用量较小时，不能将亚麻籽粉中的总酚提取出来。当乙醇用量过多时，导致超声对亚麻籽粉的作用减弱，使提取过程受到影响[10]。因此，固液比1∶15最佳。

图1 固液比对总酚提取效果的影响

2.1.1.2 超声温度对提取效果的影响

在固液比1∶15、超声时间20 min条件下，研究不同超声温度对亚麻籽总酚提取的影响，结果见图2。

图2 超声温度对总酚提取效果的影响

从图2可以看出，随超声温度升高，总酚含量增大，在超声温度40℃时总酚含量最高，之后随超声温度继续上升总酚含量下降。这可能是随着温度升高，分子运动加速使酚类物质容易穿透植物组织，但温度太高会使酚类与其他物质发生化学反应，导致结构发生变化[11]。此外，当温度过高时溶出的亚麻胶会粘在细胞壁上，从而影响多酚提取效果。因此，超声温度40℃最佳。

2.1.1.3 超声时间对提取效果的影响

在固液比1∶15、超声温度40℃条件下，研究不同超声时间对亚麻籽总酚含量的影响，结果见图3。

图3 超声时间对总酚提取效果的影响

从图3可以看出，随超声时间延长，总酚含量增大，在超声时间15 min时总酚含量最高，之后随着超声时间继续延长总酚含量降低，这与刘滨等[12]对巴山冷杉针叶多酚提取的结果相同。可能原因是超声时间较短时对亚麻籽的作用较小，不能使亚麻籽中的总酚全部提取出来，超声时间过长会使活性物质流出，溶液黏度增加，从而影响亚麻籽总酚的提取。因此，超声时间15 min最佳。

2.1.2 响应面优化实验

2.1.2.1 模型建立和方差分析

在单因素实验基础上，以固液比、超声温度、超声时间为因素，以总酚含量为指标，采用Design-Expert 7.0软件进行Box-Behnken响应面实验设计。响应面实验设计及结果见表1。方差分析见表2。

表1 响应面实验设计及结果

由表1数据得到模型回归方程：总酚含量=30.07+2.64A+0.6B+0.12C-1.39AB+0.46AC+0.68BC-2.83A2-2.96B2-2.48C2。

表2 方差分析

2.1.2.2 验证实验

通过Design-Expert 7.0软件得到亚麻籽总酚最佳提取工艺条件为固液比1∶17.3、超声温度40.1℃、超声时间15.3 min，此条件下总酚含量为30.69 mg/g。根据实际情况将实验条件修正为超声温度 40℃、超声时间 15 min、固液比1∶17，实际总酚含量为30.21 mg/g。

2.2 不同产地亚麻籽中总酚含量及抗氧化活性(见图4、图5)

图4 不同产地亚麻籽中总酚含量

图5 不同产地亚麻籽总酚抗氧化活性

从图4可以看出，青海贵德、互助、民和、三合亚麻籽总酚含量依次为28.70、24.51、23.16、25.11 mg/g，平均含量为25.37 mg/g，青海贵德的亚麻籽总酚含量明显高于青海其他3个地区亚麻籽的，而民和的亚麻籽总酚含量最低。甘肃、内蒙古、山西产地亚麻籽总酚含量依次为19.97、21.43、22.38 mg/g。

从图5可以看出，青海、甘肃、内蒙、山西4个产地亚麻籽样品都具有较强的抗氧化能力，但不同产地样品间存在差异性。其中产自青海的亚麻籽总酚抗氧化能力较强，DPPH·清除率平均为47.44%；其次为山西、内蒙古，DPPH·清除率分别为 42.43%、42.18%。产自甘肃的亚麻籽总酚抗氧化能力最弱，DPPH·清除率为41.48%。结果表明，青海亚麻籽总酚在含量水平和抗氧化能力方面占一定优势。

青海本地不同地区亚麻籽总酚DPPH·清除率大小依次为贵德 (51.06%)>三合 (49.13%)>互助 (46.94%)>民和(42.62%)。结果表明，不同产地及同一产地不同地区间亚麻籽中总酚含量及抗氧化能力存在差异，这与臧茜茜等[13]的研究结果一致。研究表明，油料的总酚含量及抗氧化活性会受品种、生长环境、气候条件、贮藏时间等因素的影响，导致总酚含量及抗氧化活性存在不同程度的差异。且不同品种的同一物种间，营养成分含量也不同[14-16]。

3 结 论

在单因素实验基础上，通过Box-Behnken响应面实验设计，得到亚麻籽总酚提取的最佳工艺条件为固液比1∶17、超声温度40℃、超声时间15 min，在此条件下总酚含量达到30.21 mg/g。

总酚含量及DPPH·清除能力实验表明，青海亚麻籽中总酚含量和抗氧化能力高于其他产地，且青海本地不同地区亚麻籽间总酚含量及抗氧化能力存在差异。青海贵德、三合、互助、民和的亚麻籽总酚含量依次为28.70、25.11、24.51、23.16 mg/g，DPPH·清除率依次为51.06%、49.13%、46.94%、42.62%。山西、内蒙古、甘肃产亚麻籽中总酚含量依次为22.38、21.43、19.97 mg/g，DPPH·清除率依次为42.43%、42.18%、41.48%。总体来说，青海亚麻籽的总酚含量及抗氧化能力高于其他产地，具有较好的应用前景。