Nanopore快速测序诊断饲养野猪非洲猪瘟疫情

2020-08-12闫晓敏任照文涂长春

中国动物传染病学报 2020年4期

闫晓敏，任照文，涂长春，何彪

（1.福建农林大学动物科学学院蜂学学院，福州350002；2.军事医学研究院军事兽医研究所，长春130122）

近年来，新发、突发传染病以及外来病给我国畜禽养殖与公共卫生带来严重挑战，准确而快速确诊是有效防控和阻止疫情扩散的重要前提。传统病原分离鉴定、抗原抗体反应以及以PCR为基础的核酸检测虽然在疫病诊断中发挥了不可或缺的重要作用，但是上述方法只能针对已知病原体，而且通常需要严格的实验室条件，对新发未知病原的检测存在技术局限性。随着Illumina测序和PacBio单分子高通量测序技术的发展，病原诊断策略得以极大改进，但由于仪器昂贵，样品前期制备周期长、建库起始核酸量要求严格，且存在扩增偏好性，缺乏本地测序能力，加上将样本运送到远程测序设施的实际困难，无法短时间内完成检测。纳米孔测序作为新兴三代测序技术在临床病原检测中展示出了较强的应用前景，由于该技术具有单分子测序、长读长及实时数据分析等优点，在基因组和转录组研究中得到越来越广泛的应用，颠覆了人们对高通量测序和疾病诊断的理解[1]。牛津纳米孔技术公司（oxford nanopore technologies，ONT）MinIONTM测序仪，重量仅90 g，携带方便，文库构建简单快速，适用于疫情现场实时诊断和数据分析[2]。2017年，Faria等[3]利用MinION在资源有限的巴西疫区对寨卡病毒和黄热病毒进行了全基因组多重扩增子测序，成功地建立了实时监测平台。2018年，尼日利亚暴发拉沙热疫情。由于拉沙热病毒的高度变异，很难通过特异性PCR扩增病毒的全基因组，英国科学家通过随机PCR扩增结合纳米孔测序在疫区现场实时完成了病毒的检测和全基因组测序分析[4]。

作为全球最大的生猪养殖和消费国，2018年8月份ASF入侵了我国，随后快速蔓延至全国[5]，并于当年11月传播到了东北地区。ASFV一旦在野猪群流行传播，将为我国ASF防控和消灭带来新的困难，因此，开展野猪疫情监测与防控对阻止病毒在野猪群的流行十分必要。为开发准确可靠的快速实时检测技术，及时获取病原的基因信息，本研究采用先进的纳米孔快速测序技术对未知病原的临床样品直接进行高通量测序，基于在线分析平台实时分析成功地诊断了一起野猪ASF疫情。建立的方法在新发或突发疫情的快速诊断以及未知病原的快速鉴定中具有重要的应用前景。

1 材料和方法

1.1 样品信息和核酸提取 2019年2月，内蒙古自治区阿尔山市大兴安岭重点国有林管局桑都尔林场散养野猪发生不明原因疫情，222头野猪中210头死亡，解剖发现病死猪脾脏显著肿大至正常脾脏的5～6倍且易碎，呈暗红发紫状态，疑似ASF。该养殖场采集一份脾脏样品送检，在P2+生物安全实验室条件下，在样品中加入裂解液灭活病原，随后加入MEM研磨，4℃、8000×g离心10 min后取上清液，用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（TIANGEN，DP315）提取总核酸，50 μL无酶水洗脱后，RNA核酸分子通过Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific K2561）合成双链cDNA，通过普通DNA产物纯化试剂盒（TIANGEN，DP204）完成DNA与cDNA的产物纯化，采用Qubit dsDNA HS分析试剂盒在Qubit4.0核酸定量仪中完成核酸定量，NanoDrop1000测定核酸纯度，然后分装储存于-80℃超低温冰箱待用。

1.2 Nanopore建库测序

1.2.1 快速建库测序纯化后的DNA与cDNA等量混合，参照纳米孔快速建库测序（RAD004，ONT）流程在10 min内完成文库构建。将测序芯片（FLOMIN106，R9.4.1）组装至MinION测序仪中，通过USB 3.0接口将MinIONTM与电脑（Intel(R) core(TM) i7-7700 @3.60 GHz；16.0 GB内存；1 TB SSD）连接。将测序文库通过Spot-ON样品端口加入到芯片后，启动离线版本MinKNOW，并实时开启EPI2ME云分析平台（https://epi2nanoporetech.com）。17 h 20 min后终止此次测序，使用Wash kit（WSH003，ONT）清洗芯片后，储存于4℃冰箱。

1.2.2 连接法建库测序为验证不同建库方案对病原体检测的时效性与准确性，进一步参照连接法测序（LSK109, ONT）说明构建测序文库，并将制备好的文库加载到R9芯片上进行1D测序，文库制备流程耗时90 min。此外，由于单张芯片测序通量限制，采用3张测序芯片并行完成连接测序，单次测序运行24 h。

1.3 非洲猪瘟病毒的定性与定量检测通过世界卫生组织（Office International dés Epizooties，OIE）推荐的引物与特异性实时荧光定量PCR检测技术[6]，对野猪源ASFV做进一步验证与定量检测。特异性PCR产物经琼脂糖凝胶分析，胶回收目的片段，构建标准质粒，并按照101～108copies/μL稀释8个梯度。荧光定量PCR程序设定：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，55℃退火 10 s收集荧光，45个循环。

1.4 Sanger全基因组测序参照ASFV Georgia 2007毒株[7]（GenBank登录号：NC044959.1）的全基因组序列设计329对引物序列，采用一代Sanger技术进行基因组测序，根据扩增片段的重叠区域进行SeqMan全基因组拼接，该部分测序与拼接工作由吉林省库美生物科技有限公司完成。

1.5 生物信息学分析

1.5.1 Nanopore数据分析通过cd-hit软件的默认参数对原始数据（Raw data）去除接头，Filtlong软件过滤小于300 bp的短片段和平均质量值小于7的低质量的序列，得到总的Clean data用于后续分析，并通过NanoPlot进行数据统计分析。BWA-MEM[8]采用默认参数将过滤后的数据映射到本地核苷酸序列数据库，并对得到的病毒序列进行在线BLAST验证。

1.5.2 ASFV有参组装与可视化分析利用Minimap2[9]将测序数据比对到Sanger全基因组，Miniasm进行基因组拼接。Samtools[10]进行数据排序，并建立索引。通过Integrative Genomics Viewer（IGV）可视化序列覆盖度，以及序列的插入缺失情况。

1.5.3 多序列比对与系统发育分析对Sanger测序及Nanopore测序获得的序列进行随机筛选，得到ASFV D345L基因的603 bp部分重合片段，采用MEGA 7.0[11]进行多序列比较及系统发育分析，并利用最大似然法中的Tamura3-parameter模型以及Bootstrap1000构建系统发生树。

2 结果与讨论

2.1 未知病原的快速检测临床研究中，在短期内实现新发突发病原体的快速检测与鉴定对于重大突发疫情的应急处置与防控工作至关重要。牛津纳米孔公司的MinIONTM测序仪小巧便携，可快速布防于条件受限的疫区，在疫情现场与笔记本电脑和无线WiFi连接，即可实时读取数据完成病原体的快速检测。美国农业部在2019年借助MinIONTM测序仪对于实验室分离培养的ASFV毒株以及实验感染猪的全血样本进行富集后在短期内快速检测到了ASFV的特异序列[12]。本研究直接针对疑似野猪临床脾脏样本，在样本送达实验室后150 min内即完成了样品的前期制备，经10 min快速构建文库，结果在测序4 min时首批获得1.25 kb的序列读数（reads），实时数据量806.98 kb，同步EPI2ME数据时分析比对得到了有效覆盖ASFV全基因组的特异性序列，在获取序列的时效性上远优于其他测序平台。测序运行17 h 20 min后共计获得1.06 GB原始测序数据，共计553 071条reads。通过生物信息分析流程比对得到367条病毒reads，其中213条（58.04%）比对为ASFV基因序列，其余为猪内源性逆转录病毒（16.89%）、猪巨细胞病毒（25.07%）。此外还获得103 020条噬菌体序列，由于样品处理前期未去除宿主基因组，因而宿主基因组序列占据全部reads的81.31%。对于复杂稀缺的临床样本类型，可根据实际需求去除宿主基因组，实现样本富集从而节约测序成本获取更多有效数据。另一方面，将Nanopore测序技术与病毒宏基因组研究手段相结合可满足于疫情突发时对未知病原快速检测需求。

2.2 ASFV的荧光定量检测为验证上述结果，采用ASFV P72基因特异PCR对野猪脾脏组织样本进行了检测，结果成功地扩增出了250 bp目的片段（图1），确诊野猪样品为ASFV阳性，与纳米孔测序结果完全一致。进一步荧光定量PCR方法对该样品进行ASFV基因定量检测，结果显示病毒载量为2.1E+6 copies/200 mg。该样品中的病毒量相对较高，且ASFV基因组较大，Nanopore测序技术针对此类临床样本无需PCR扩增直接建库测序，由此表明，Nano pore测序技术非常适用于ASF的临床快检应用。

2.3 Sanger全基因组测序结果经Sanger测序技术最终获得该样品ASFV毒株基因组全长189 403 bp，命名为InnerMongolia-AES01。截取其P72基因在NCBI网站进行在线BLAST分析，结果显示，该序列与ASFV Georgia 2007株、中国流行毒株同源性为100%，同属于基因Ⅱ型。该毒株全基因组包含188个ORFs，序列已上传至GenBank数据库，登录号为MK940252。

图1 非洲猪瘟病毒P72基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplified P72 gene from ASFV

2.4 纳米孔测序结果

2.4.1 测序数据统计分析将原始测序数据过滤后进行NanoPlot统计分析，结果见表1。从表中可以看出通过连接法（LSK）测序获得的数据，无论在测序通量或者是测序读长与序列质量方面，均优于快速测序方案，对3次连接测序结果进行分析，原始数据过滤后获得9.0 GB过滤后数据，与核苷酸数据库比对后获得到1826条ASFV序列，最快得到ASFV序列耗时3 h。本研究通过比较分析快速测序和连接法发现，连接法获取病原微生物的时效性较差，但是序列质量更高，适用于病原基因组特征的研究。

表1 过滤后测序数据统计Table 1 Statistics of Nanopore clean data

2.4.2 ASFV序列统计图2表明，经Nanopore快速测序与连接测序方案共同获得的2039条ASFV序列与Sanger测序获得的全基因组数据（GeneBank登录号：MK940252）相比较，同源性为74.32%～100%，最短读长仅116 bp，最长读长19 821 bp，覆盖ASFV基因组的10.46%，大多数序列读长在500～5000 bp，在序列读长方面远优于二代illumina测序，但是序列准确度仅为77.78%与85.64%，不及其他测序平台得到的数据准确高。

图2 ASFV序列读长与同源性分布图Fig.2 ASFV sequence read length and identity

2.4.3 ASFV序列的可视化本研究通过Minimap2软件将Nanopore测序数据比对到ASFV参考基因组，并借助IGV软件将比对结果进行可视化。从图3可以看出测序所得序列对ASFV全基因组序列覆盖度良好，单位点平均测序深度5.02，最大测序深度14，整体ASFV序列覆盖率达99%。图3、图4显示，Nanopore测序数据存在大量的插入与缺失。图4中红色标记的SQK-RAD04与SQK-LSK109序列中能直观观察到多个位点存在1～2个碱基的插入与缺失，由此，导致两者与Sanger测序获得的AES01株亲缘关系偏离，但是所得到的序列仍与ASFV基因Ⅱ型株序列处于同一进化分支，表明Nanopore测序所得数据虽能判定病毒种类但其准确度仍存在较大改进空间。对于Nanopore测序得到的reads非偶然的片段插入与缺失，需要提高测序深度或者采用2+3的组装策略才能获得高质量的全基因组序列。因而将两种建库策略获得的ASFV特异性序列进行初步组装后覆盖了99%的全基因组序列，但是由于测序深度的限制，导致拼接后的序列仍存在个别位点的插入与缺失。下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术能够获得良好的基因组覆盖深度，但是短读长的技术特点以及测序中引入的扩增会使得组装结果的片段化。ASFV基因组两端为反向重复序列，因而需要利用Nanopore测序产生的长读长序列构建基因组框架，进一步借助NGS平台填补框架，从而在短期内完成基因组拼接工作。刘翟等[13]借助通量更高的Nanopore PromethION平台以及NGS测序平台采用2代+3代测序组装策略完成了ASFV病毒分离株的测序与全基因组拼接工作，对于大基因组精准组装方面具有重要参考意义[13]。但是PromethION测序仪相对于掌上MinIONTM测序仪可移动性较差，不利于疫情暴发现场测序平台的快速布置，因而对于新发突发与再发病原体的快速识别与鉴定方面，Nanopore MinION测序平台仍有不可比拟的应用优势。

综上，本研究基于先进的Nanopore测序与便携式高性能计算机平台在4 min内于一起发病的家养野猪体内实时检测到了ASFV的特异性序列，一方面，实现了对临床样品ASFV的快速检测，表明 Nanopore测序技术在新发或突发传染病的快速诊断以及未知病原的快速鉴定中具有重要的应用价值；另一方面，本研究明确了ASF在家养野猪群中的传播与流行，进而扩大了ASF的宿主与地理分布范围，提示在ASF疫情的消灭战役中应注意加强对野猪群的监测与防控。