高效液相色谱-二极管阵列检测器法检查复方罗布麻片Ⅰ中掺伪大花罗布麻叶方法研究*

2020-08-12谢思敏刘主洁侯惠婵顾利红

中国药业 2020年15期

谢思敏，刘主洁，侯惠婵，顾利红

（广东省广州市药品检验所，广东广州 510160）

复方罗布麻片Ⅰ是由罗布麻叶、野菊花、氢氯噻嗪等10 味中药材、化学药物组成的复方制剂，为治疗高血压的常用药。现行质量标准收载于《国家药品标准·化学药品地方标准上升国家标准（第十一册）》，其中有盐酸氯丙嗪、防己的薄层色谱鉴别和氢氯噻嗪、维生素B1/B6的液相色谱鉴别，同时还有氢氯噻嗪的含量测定方法，但并未对处方中罗布麻叶Apocynum venetumL.进行质量控制。日常检验中发现，罗布麻商品药材使用较混乱，常以大花罗布麻叶Poacynum hendersonni（Hook.f）Wodson 混充罗布麻叶Apocynum venetumL. 使用。文献［1-4］报道，通过测定复方罗布麻片Ⅰ中金丝桃苷、芦丁含量，可对复方罗布麻片Ⅰ中罗布麻叶进行质量控制。前期研究中发现，以白麻苷、金丝桃苷为指标性成分，可快速鉴别罗布麻叶和大花罗布麻叶［5-6］。为进一步探索含罗布麻叶的复方制剂复方罗布麻片Ⅰ在生产过程中是否存在掺伪大花罗布麻叶，本研究中采用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）法测定了复方罗布麻片Ⅰ中白麻苷、金丝桃苷的含量，可快速、准确地检查复方罗布麻片Ⅰ中是否掺伪大花罗布麻叶，并进一步采用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）法进行确证。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260 型二极管阵列检测器-高效液相色谱仪，Chem-Station C 色谱工作站（美国安捷伦公司）；3200QTRAP 型液质联用仪，Analyst 1.7 分析软件（美国AB 公司）；MS105型电子天平（精度为万分之一），XP26 型电子天平（精度为百万分之一），均购自瑞士Mettler Toledo 公司。

1.2 试药

复方罗布麻片Ⅰ样品（共21 批，企业A，编号为A1 ～A10；企业B，编号为B1 ～B6；企业C，编号为C1 ～C5）；罗布麻叶药材（共8 批，编号为罗布麻叶1 ～8），大花罗布麻叶药材（共7 批，编号为大花罗布麻叶1 ～7），均经广州市药品检验所中药室侯惠婵主任中药师鉴定为正品；罗布麻叶对照药材（批号为120979-200704），金丝桃苷对照品（批号为111521-201708，纯度为95.1%），均购自中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）；白麻苷对照品（成都德思特生物技术有限公司，批号为DST180404-076，含量不低于98%）；甲醇、乙腈（HPLC 级，德国Merck 公司）；冰醋酸、醋酸（色谱纯，美国阿拉丁公司）；自制Milli-Q 超纯水；其余试剂均为分析纯，均购自广州化学试剂厂。

图1 高效液相色谱图

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenon Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-1%冰醋酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～30 min 时10%A→20%A，30 ～31 min 时20%A→95%A，31 ～38 min 时95%A，38 ～39 min 时95%A→10%A，39 ～48 min 时10%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：354 nm；柱温：50 ℃；进样量：5 μL。

2.2 溶液制备

称取白麻苷对照品5.79 mg、金丝桃苷对照品5.64 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得白麻苷、金丝桃苷混合对照品贮备液；精密量取混合对照品贮备液5 mL，置10 mL 容量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。取本品20 片，糖衣片除去包衣，精密称定，研细，取约10 片重，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得复方罗布麻片Ⅰ供试品溶液。取药材粉末约0.1 g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得药材供试品溶液。按样品处方工艺制备缺罗布麻叶药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备，即得阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.2 项下对照品溶液、复方罗布麻片Ⅰ供试品溶液、阴性对照品溶液各5 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱峰。结果白麻苷、金丝桃苷的保留时间分别约为18.619 min 和25.617 min，理论板数按白麻苷峰计应不低于10 000，基线分离良好，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察：分别精密量取混合对照品贮备液1 mL，置1，2，5，10，25，50 mL 容量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，即得系列质量浓度对照品溶液。再分别吸取系列对照品溶液各5 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表2。

表2 线性关系考察结果（n=6）

精密度试验：精密吸取2.2 项下混合对照品溶液5 μL，按拟订色谱条件连续进样6 次，测定。结果白麻苷、金丝桃苷峰面积的RSD分别为0.37%和0.13%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液（编号为A4，B5），室温放置，分别于0，2，6，12，24 h 时按拟订色谱条件进样测定。结果白麻苷、金丝桃苷峰面积的RSD分别为0.51%和0.87%（n=5），表明供试品溶液在24 h 内稳定。

重复性试验：取同一批（编号为A4）样品6 份，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果白麻苷含量的RSD分别为0.99%（n=6），表明方法重复性良好。

表3 加样回收试验结果（n=6）

加样回收试验：取同一批（编号为A4）样品0.5 g，精密称定，共6 份，分别精密加入混合对照品贮备液5 mL，再精密加入70%甲醇20 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，并计算回收率。结果见表3。

检测限确定：取加样回收试验项下编号3 供试品溶液，加入70%甲醇分别稀释250 倍（金丝桃苷质量浓度为0.042 7 μg /mL）及500 倍（白麻苷质量浓度为0.041 5 μg /mL），分别进样5 μL，取样量以10 片计，按信噪比为3 ∶1 计算检测限。结果复方罗布麻片Ⅰ中白麻苷、金丝桃苷的检测限为每片0.1 μg。

2.4 样品含量测定

分别取21 批复方罗布麻片Ⅰ样品、收集的8 批、中检院的1 批罗布麻叶和7 批大花罗布麻叶药材，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，并计算含量。结果见表4 至表5。

表4 复方罗布麻片Ⅰ样品含量测定结果（μg/片，n=2）

2.5 HPLC-MS 法确证

色谱柱：Agilent -poroshell 120 C18柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5% 醋酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～8 min 时13%A →20%A）；流速：0.4 mL/min；质谱检测器：电喷雾负离子模式（ESI-），选择多反应监测（MRM），白麻苷选择质荷比（m/ z）625.0（双电荷）→300.4、m/ z625.0（双电荷）→271.2 和m/ z625.0（双电荷）→255.2 作为检测离子对，金丝桃苷选择质荷比（m/ z）463.1（双电荷）→300.4、m/ z463.1（双电荷）→271.2 和m/ z463.1（双电荷）→255.1 作为检测离子对；柱温：30 ℃；进样量：1 μL。对罗布麻叶（编号为3 ～4）、大花罗布麻叶（编号为4 ～5）及复方罗布麻片Ⅰ（企业A，编号为A3 和A4；企业B，编号为B1 和A2；企业C，编号为C1 和C5）中白麻苷、金丝桃苷的含量与HPLC-DAD 测定结果比较，RSD均小于2.5%，表明HPLC-DAD 法和HPLC-MS 法测定结果无显著差异。

表5 罗布麻叶及大花罗布麻叶样品测定结果（%，n=2）

3 讨论

3.1 色谱条件选择

白麻苷、金丝桃苷的全光谱扫描图显示，白麻苷在256 nm 和354 nm 波长处有最大吸收，而供试品溶液在354 nm 波长下，干扰少，故选择354 nm 为检测波长。本试验中考察了不同的流动相、不同品牌的色谱柱，不同柱温下白麻苷的分离情况及对测定结果的影响，结果显示，采用乙腈-1%冰醋酸溶液为流动相，在Agilent，Phenomenex，Waters 3 个品牌的色谱柱下，白麻苷、金丝桃苷均能得到有效分离，阴性对照无干扰；随着柱温的升高，可得到更好的分离度，故选择50 ℃为柱温。

3.2 样品中掺伪情况

本试验收集的8 批、中检院的1 批罗布麻叶和企业B 生产的6 批、企业C 生产的5 批复方罗布麻片Ⅰ均检出金丝桃苷，未检出白麻苷；收集的7 批大花罗布麻叶和企业A 生产的11 批复方罗布麻片Ⅰ均检出白麻苷，未检出金丝桃苷。由此推断，企业A 生产的复方罗布麻片Ⅰ中存在以大花罗布麻叶充当罗布麻叶投料的情况；而企业B 和企业C 在生产中不存在掺伪大花罗布麻叶的现象，但其金丝桃苷含量存在较大差异。可见，对复方罗布麻片Ⅰ中的罗布麻叶进行质量控制十分有必要。