野生对虾白斑综合征和早期死亡综合征病原的流行情况调查

刘 苏，郭宜欣 ，张海发，杨宇晴，吴锦辉，石和荣，黄锦雄，黄培卫

（1.广东省海洋渔业试验中心，广东 惠州 516081；2.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225）

【研究意义】对虾泛指甲壳类、十足目、对虾科、对虾属内各个品种，其中凡纳滨对虾、斑节对虾、中国对虾、日本对虾是我国重要的养殖品种。对虾具有生长速度快、营养需求低等特点，深受养殖者青睐；而其肉质鲜美、营养价值高［1］，颇受消费者喜爱。我国是对虾养殖大国，对虾产业在良种繁育、规模养殖、加工流通等方面已形成完整的产业链［2］，2018年海水养殖产量达140.9万t［3］。对虾养殖在增加渔民收入和出口创汇方面贡献巨大，社会经济效益显著［4］。由于集约化养殖程度的提高，对虾病害日趋严重，成为影响对虾养殖产量的主要因素之一。【前人研究进展】20世纪90年代初，对虾的白斑综合征（White Spot Syndrom，WSS）及早期死亡综合征（Early Mortality Syndrome，EMS）开始暴发，患病对虾死亡率极高，受病害影响，世界对虾产量剧减，给养殖业带来了巨大损失，严重危害养殖业的发展［5-7］。随着近年对虾养殖模式的改进及病害防控措施的提升，世界对虾产量有所回升，2019年产量达到330万t。目前，白斑综合征及早期死亡综合征已遍布世界各地的对虾养殖国家，尤其对亚洲和南美洲等众多对虾养殖主产区国家影响严重。有关上述两种病害的检测方法已建立甚至已成熟应用［8-10］，相关防治方法也开始受到重视［11-14］，但至今仍未找到有效的治疗方法。对白斑综合征及早期死亡综合征仍以预防为主，需从保证虾苗质量、建立良好养殖水环境等方面来开展工作。【本研究切入点】我国对虾的亲虾资源匮乏，来源主要为捕捞海里的野生对虾或从国外进口［15］。调查大亚湾海域的野生对虾白斑综合征及早期死亡综合征病原携带情况，对了解海捕亲虾群体的健康情况以及流行病的发生规律具有重要意义。【拟解决的关键问题】通过对两种病害病原分布规律的研究分析，以期为保护野生虾类的种群稳定、维持海洋生态平衡提供基础数据，为对虾养殖中的病害预警及防控提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在2018年8—12月、2019年1—4月以及8—12月期间，每月在大亚湾海域3个不同地点收集捕捞野生对虾，每个地点取样20尾左右，共取样960尾。取每尾对虾的肝胰腺置于装有无水乙醇的样品管中，-20℃保存备用。

1.2 试验方法

样品DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒。白斑综合征检测引物、早期死亡综合征检测引物及十足类通用引物序列［8-9］如表1所示，引物由英潍捷基贸易有限公司合成。

试验以确认为感染白斑综合征死亡的病虾提取基因组DNA作为白斑综合征阳性对照，对疑似受白斑综合征感染死亡的病虾提取基因组DNA，用白斑综合征引物进行PCR扩增，将阳性产物送英潍捷基贸易有限公司测序；以含早期死亡综合征引物扩增目的基因的载体质粒作为早期死亡综合征阳性对照，由英潍捷基贸易有限公司合成。试验均以双蒸水作为空白对照。

PCR反应试剂采用天根生化科技（北京）有限公司的2×TaqPCR Mastermix试剂盒，反应体系为 20 µL：2×TaqPCR Mix 10 µL，样品DNA或阳性对照、空白对照1 µL，正/反向引物各 1 µL，ddH2O 7 µL。PCR 反应程序：95℃5 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s和 72℃ 2 min，40个循环；72 ℃ 5 min，4℃保温。反应结束后，以0.5 µg/mL的4S GelRed核酸染料显带，在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物，在紫外照胶仪中观察结果并拍照。

2 结果与分析

2.1 样品DNA提取结果

样品DNA提取结果见图1，在2 000 bp以上均有明显亮带。提取的DNA经十足目通用引物PCR扩增（图2），在848 bp处有条带且较亮，表明样品DNA质量较好。

图1 DNA样品琼脂糖电泳结果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis result of DNA samples

2.2 大亚湾海域野生对虾白斑综合征检测结果

图2 DNA质量检测结果Fig. 2 PCR amplification by primers of decapods

对虾白斑综合征PCR扩增检测结果见图3，阳性样品在1 447 bp处均有条带，阴性样品则无此条带。从表2调查结果可知，2018年8—12月期间，8月所有样品检测均呈阴性，其余月份均有阳性样品，其中9、10月阳性率较高，分别为47.37%、41.67%，11月阳性率较低（1.67%）。2019年1—4月、8—12月期间，1月及8—10月所有样品检测均呈阴性，其余月份阳性率也均低于10%的水平。结果表明，大亚湾海域野生对虾群体携带白斑综合征病毒的比率在时间上无特定的分布规律，无论是夏季还是冬季均有携带可能，甚至出现高阳性率。2019年检测的阳性率均较低，平均阳性率为2.43%，明显低于2018年的平均阳性率22.96%。

2.3 大亚湾海域野生对虾早期死亡综合征检测结果

图3 大亚湾海域野生对虾白斑综合征PCR检测结果Fig. 3 PCR detection result of WSS in wild prawns from Daya Bay

表2 大亚湾海域野生对虾白斑综合征检测结果Table 2 Detection result of WSS in wild prawns from Daya Bay

图4 大亚湾海域野生对虾早期死亡综合征PCR检测结果Fig. 4 PCR detection result of EMS in wild prawns from Daya Bay

表3 大亚湾海域野生对虾早期死亡综合征检测结果Table 3 Detection result of EMS in wild prawns from Daya Bay

对虾早期死亡综合征PCR扩增检测结果见图4，阳性样品在284 bp处均有条带，阴性样品则无此条带。从表3调查结果可知，2018年8—12月均检测到对虾早期死亡综合征病菌，其中阳性率最高为8月份（63.04%），最低为10月份（3.33%）。2019年1—4月、8—12月期间，8月份所有样品检测均呈阴性，其余月份均有阳性样品，其中3月和12月阳性率较高、分别为92.45%和94.00%，9月和10月阳性率较低、分别为1.70%和1.67%。结果表明，大亚湾海域野生对虾群体携带早期死亡综合征病菌的比率高，2018年所检测月份的平均阳性率达29.93%，2019年达41.33%。阳性率在时间上无特定的分布规律，无论是夏季还是冬季均有携带可能，甚至出现高阳性率。

3 讨论

我国对对虾疾病研究得比较晚，虽然近年关于白斑综合征及早期死亡综合征的研究有了很大进展，但很多问题仍未得到解决。国内苗种培育的对虾亲本主要从南海海域捕捞或者从国外进口，而大亚湾是我国南海的重要海湾，水产资源丰富，因此保护好大亚湾海域的水资源环境、生态环境是一项重要任务。通过检测了解海区流行病的发生规律，掌握野生对虾的健康情况，对维持和保护野生对虾的种群稳定、维持海洋生态平衡具有重要指导作用。

3.1 切断病毒感染和传播源头，预防白斑综合征暴发

对虾白斑综合征是由对虾白斑综合征病毒引起的对虾传染性疾病，是迄今为止被认为是影响最大、危害最大的对虾疾病［16］。该病毒传染性强，可以水平传播，发病的虾肉和发病虾池里的浮游生物都能诱使健康对虾发生急性白斑综合征［17］；也能垂直传播，对发病对虾组织学检查发现，对虾精巢、精荚、卵巢中都有白斑综合征分布［18］，而且以感染白斑综合征的亲虾产卵育苗，其仔虾也携带白斑综合征［19］。白斑综合征容易导致全池感染，病程短，感染白斑病后3～10 d死亡率高、可达100%［20］。至今仍没有该病的有效治疗方法，因此要通过早期预防来减少白斑综合征感染。一般预防可从环境、虾种本身和药物等方面进行。本调查结果显示，大亚湾海域野生对虾群体携带白斑综合征病毒的比率较低，2019年全年阳性率均低于10%的水平。鉴于其携带率低的特点，通过对捕捞的亲虾进行调查筛选，减少对虾白斑病垂直传播，可有效减少养殖生产中白斑综合征的发生。为从源头切断白斑综合征病毒的感染和传播，通过人工选育的方法培育无病毒的亲虾群体，并以此培育无病毒的对虾苗种显得至关重要［15］。同时，育苗中应做好生物饵料的病原检测，确保合格再投入使用；养殖中控制放养密度，并通过在饲料中添加中草药、粘多糖等制剂提高虾苗免疫力，以达到预防白斑综合征的暴发［21］。

3.2 改善养殖环境，控制养殖容量，实现早期死亡综合征生态防控

早期死亡综合征又称急性肝胰腺坏死综合征（AHPND），2009年该病在亚洲地区暴发，之后蔓延至全世界。该病一般在投苗30 d内暴发［22］，发病急、致死率高、流行范围广。对虾在投苗初期快速死亡，死亡损失可高达80%。病虾颜色发白且带微红，肝胰脏异常肿大且质地松软，游动缓慢，通常在水面上或趴在养殖塘边［22-23］。目前对早期死亡综合征的发病机理还没有定论，诊断和防治仍在努力完善中［24-25］。关于早期死亡综合征的病因研究，多数学者认为该病的主因可能是一种副溶血性弧菌变异释放出某种毒素［9］，同时恶劣的养殖环境促使其暴发［26］。对病虾中的副溶血性弧菌菌株基因组序列进行比较，鉴定出两个与昆虫毒素基因同源性很高的基因，是关键的早期死亡综合征致病因子［9］。但这两种毒素蛋白如何影响肝胰腺并导致对虾发病尚不清楚。本调查结果显示，大亚湾海域野生对虾群体携带早期死亡综合征病菌的比率高，且时间上呈现全年携带的趋势，可见导致早期死亡综合征的副溶血弧菌是环境中的一种常见菌，在养殖中发病很大可能是由恶劣环境所致，防控措施主要从养殖环境和容量控制两方面进行。养殖初期应根据池塘条件合理控制放养密度，避免后期养殖生物量超出池塘环境承载力；养殖中后期应做好投喂管理，避免过量投喂导致水体富营养化，同时施以光合细菌、芽孢杆菌等有益微生态制剂，辅助建立良好的菌相、藻相等微生态环境，给虾苗提供优良生长环境条件［6］。

4 结论

大亚湾海域野生对虾群体的白斑综合征病毒携带率及早期死亡综合征病菌携带率在时间上无特定的分布规律，在夏季或冬季均有携带可能，甚至出现高阳性率。白斑综合征病毒携带率总体处于较低水平，所检测的14个月份中有5个月份未检测到阳性样品，2018年检测月份的平均阳性率为22.96%，2019年所检测月份的阳性率均低于10%的水平，平均阳性率为2.43%。基于其阳性率较低的特点，可通过对捕捞亲虾进行调查筛选，培育无白斑综合征的亲虾品系和对虾苗种，配合饵料中病毒检测以及养殖环境条件的控制，以达到预防白斑综合征暴发。而早期死亡综合征病菌携带率总体处于较高水平，2018年所检测月份平均阳性率达29.93%，2019年达41.33%，单月最高阳性率可达94.00%。其发病很大可能是由于恶劣环境所致，因此可通过改善养殖环境、建立科学规范的养殖体系防止其在养殖生产中暴发。