医用菌株保存方法的研究——以土壤杆菌为例

陈 璐 姚博伟 姚登明

（1、宁夏师范学院，宁夏 固原756000 2、宁夏计量质量检验检测研究院，宁夏 银川750000）

可得然胶是一种重要的食品添加剂，其产生菌株土壤杆菌（Alcaligenes faecalis）最初是由日本的原田笃也（Tokuya Harada）教授于1964 年从土壤中发现的。可得然胶由于具有加热成胶的特性，也被称为热凝胶。日本Takeda 公司对可得然胶的食用安全性进行了相关的研究及评价，研究结果表明可得然胶无诱变性和致癌性，食用时不会导致某些急性慢性疾病的发生。1989年在美国、日本、韩国及中国台湾等国家和地区开始广泛生产和使用可得然胶，并于1996 年12 月经美国FDA 批准可得然胶可以作为增稠剂、稳定剂等直接用于食品工业中，2006 年6 月我国卫生部批准可得然胶作为食品添加剂应用于食品中。

随着我国食品产业的快速发展，可得然胶产生菌株得到了广泛的应用，因此该菌株的保藏是一项非常重要的工作。目前常用的菌种保藏方法有斜面琼脂低温保存、液体石蜡保存、真空冷冻干燥保存及液氮超低温保存[1,2]，而真空冷冻干燥保存技术相较于其它保藏方法具有低温、干燥及真空的优良条件，能够有效地使细胞处于基本休眠状态，并一定程度内抑制生长繁殖，从而降低菌种的死亡率及变异率，现已得到广泛的应用。但是如果直接用菌液冻干保存，其存活率非常低，由于保护剂可以尽可能的保护其生物活性和生理生化特性，从而减轻冷冻干燥过程中对菌体的损害[3],因此添加不同保护剂以提高冻存效率是关键。

本文以实验室保存的一株土壤杆菌714 为研究对象，采用单因素试验及正交试验设计，对各类保护剂进行筛选并优化出最佳的保护剂配方，从而最大程度地减少冻存对菌种产生的伤害，提高菌种的存活率，并保持良好的产可得然胶的性能，以期更好的应用于食品工业中。

1 材料与方法

1.1 实验材料与实验设备

1.1.1 菌株

土壤杆菌（Alcaligenes faecalis）714,由华东师范大学微生物实验室保存。

1.1.2 培养基

（1）种子培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH=7.2，121 °C 灭菌20 min 备用。（2）计数培养基为种子培养基中添加2%琼脂粉；（3）保护剂溶液配制：根据质量比配制各种保护剂溶液。

1.1.3 主要试剂与仪器

1.1.3.1 试剂：市售食品级脱脂乳粉、麦芽糊精，蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、氢氧化钠、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘油，所用试剂均为生化级，购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。

1.1.3.2 仪器：GNP-9160 型隔水恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；DL-CJ-2NDI 型超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；BL-100A 型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实验设备有限公司；超低温冰箱，辽宁瀚珑廷生物科技有限公司；CR-21N 高速冷冻离心机，上海赛默飞生物有限公司；真空冷冻干燥机，宁波新之生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验流程: 菌种活化→离心收集菌体→生理盐水清洗菌体→加入不同冻干保护剂→分装安瓿管→预冻→真空冷冻干燥→冻干菌粉→复水→活菌计数→计算存活率。

1.2.2 菌种活化及菌悬液的制备

从斜面上刮取一环新鲜的菌种接入到种子培养基中，250r/min，30℃培养16h，取等量种子液于无菌离心管中，10000r/min 离心5min，弃上清，菌体用无菌生理盐水清洗两次，10000r/min 离心5min，用等体积不同保护剂溶液重悬菌体，制成菌悬液，取样计数，并吸取菌悬液分装至无菌的安瓿管中，每管300ul。

1.2.3 冷冻干燥

将分装有菌液的安瓿管置于-80℃冰箱中预冻2h，然后迅速将彻底冻结的菌液转移至真空冷冻干燥机中，启动冻干程序进行抽真空干燥，冷冻干燥24h。

1.2.4 冻干前细胞总数的测定

吸取100μL 菌液用无菌水10 倍梯度稀释，选择合适的稀释梯度，吸取100μL 菌悬液涂布于计数培养基上，每个梯度做3 个平行，将平板放入恒温培养箱中，30℃倒置培养，待菌落长出后，计数，根据稀释倍数计算原菌悬液中的细胞总数。

1.2.5 冻干存活率的测定

向冻干后的各菌粉中加入等体积无菌水，充分溶解混匀后，梯度稀释涂布计数，冻干后细胞存活率计算式如下：

冻干存活率（%）=每ml 菌悬液冻干后存活细胞数/冻干前每ml 菌悬液中的细胞总数X100%

1.2.6 单一保护剂的选择

1.2.6.1 保护剂的筛选

菌株714 用种子培养基活化后，离心收集菌体，用各种保护剂溶液重悬菌体，真空干燥机中冻干，稀释涂布，计算存活率。根据相关文献报道[4-7]，本文中所选用的冻干保护剂种类及浓度如表1 中所示。

表3 正交试验因素及水平

表1 保护剂种类及浓度

1.2.6.2 冻干保护剂浓度的优化

分别选取各类保护剂中保护效果最好的保护剂对其浓度进行优化，试验中所选用的保护剂种类及浓度如表2 中所示。

表2 保护剂浓度

1.2.6.3 复合保护剂的选择

根据单因素实验的结果，从各大类保护剂中分别选出一种保护效果好的保护剂，利用正交设计软件，采用L9(33)设计正交试验，正交试验设计见表3。

1.2.6.4 数据分析

用Excel2013、Graphpad prism7.0 及正交设计助手II 对结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 保护剂的筛选

选用糖类、醇类和大分子类共11 种常用的保护剂，考查在菌株714 冻干过程中的保护效果。从表4 结果可以看出，在糖类物质中，海藻糖对菌体具有较好的保护效果，其存活率为36.7%，在多元醇中，山梨醇较甘油及甘露醇保护效果好，大分子物质脱脂奶粉保存效果相对较好，综合上述结果，选用海藻糖、山梨醇及脱脂乳粉作为冻干保护剂，进行下一步单因素试验。

表4 不同保护剂对菌株冻存的影响

2.2 冻干保护剂浓度的优化

2.2.1 脱脂奶粉浓度优化

图1 为脱脂奶粉浓度对菌株冻存的影响。可以看出，脱脂奶粉对菌体具有一定的保护效果，且脱脂奶粉浓度不同时存活率也有所差异。当脱脂奶粉浓度低于15%时，随着脱脂奶粉浓度的增加，存活率逐渐增加；当脱脂奶粉浓度为15%时，存活率最高，为32.5%。当脱脂奶粉浓度大于15%时，存活率有所下降。这可能是在菌种冻存中脱脂奶粉能减少细胞暴露于氧气和介质中的面积，同时乳清蛋白能在菌体表面形成蛋白膜，对细胞进行保护，并可固定冻干酶类，减少由于细胞壁损坏而引起的胞内物质泄漏，从而起到较好的保护作用[8]，另外，脱脂奶粉中含有的乳糖也能起到保护的作用[9]。

图1 脱脂奶粉浓度对菌株冻存的影响

2.2.2 海藻糖浓度优化

图2 为海藻糖浓度对菌株冻存的影响。当海藻糖浓度为4%时，保护效果最好，存活率最高为65.2%，随着海藻糖浓度的增加，菌株存活率逐渐降低。海藻糖相较于脱脂奶粉表现出明显的保护优势，其冻干后最高存活率可达到脱脂奶粉的近2 倍。其原因可能是海藻糖具有较大的水化体积，能竞争更多的蛋白质水化层中的水，使蛋白质结构更为紧密，不易受到外界不利环境的影响，且在同等条件下，海藻糖显示了最高的玻璃化相转变温度，表现出优越的保护效果[5]，另外由于海藻糖分子较小，容易进入蛋白质分子的空隙中，一定程度上抑制了蛋白质分子内部结构的变化，从而有效地避免了蛋白质变性失活[10]。

图2 海藻糖浓度对菌株冻存的影响

2.2.3 山梨醇浓度优化

图3 为山梨醇浓度对菌株冻存的影响。随着山梨醇浓度的增加，菌株存活率也逐渐增加，当山梨醇浓度为7%时，保护效果最好，存活率最高为43.9%；当山梨醇浓度大于7%时，存活率略有下降。这可能是由于山梨醇可以和细菌的细胞膜发生相互作用，一定程度上对细胞膜起到保护作用，另外还可以和细胞中的蛋白质之间形成氢键，稳定了蛋白质的结构特性及相关功能特性，从而对菌体起到保护作用[11]。相关文献报道山梨醇在乳酸菌冻存中也有较好的保护效果[12]。

图3 山梨醇浓度对菌株冻存的影响

2.3 正交试验优化菌种冻干保护剂

根据上述单因素试验对保护剂的筛选，得到脱脂奶粉、山梨醇及海藻糖对菌种冻干有较好的保护效果，且最优保护剂浓度依次为10%、7%及4%。但是单一的保护剂冻干存活率相对较低，因此在单因素试验的基础上，进一步优化复合保护剂的效果。用正交设计软件助手设计了三因素三水平L9(33)的正交试验，以菌株的存活率为评价指标，结果见表5。

表5 正交实验结果与分析

由极差R 可以判断，对菌种冻存后存活率的影响程度依次为脱脂奶粉＞山梨醇＞海藻糖。从存活率可以看出，当组合为脱脂奶粉10%、山梨醇5%、海藻糖1%时，保护效果最好，此时存活率为87.2%，大于任一单一因素的存活率，优化效果明显。通过表6 中的方差分析表明，脱脂奶粉的F 值大于F 临界值，说明脱脂奶粉对菌体冻存具有显著性的影响，因此极差分析和方差分析结果一致。

表6 显著性分析

3 结论

试验表明，菌种在真空冷冻干燥过程中，添加保护剂对菌体存活率有很大的影响。通过单因素试验从糖类、多元醇类及大分子类共11 种物质中分别筛选得到海藻糖、山梨醇及脱脂奶粉对菌株冻干有较好的保护效果，且最优保护剂浓度依次为4%、7%及15%。正交试验得到土壤杆菌存活率最高的保护剂配方为：脱脂奶粉10%、山梨醇5%、海藻糖1%，冻干后菌株的存活率可达87.2%，大于任一单一因素的存活率，优化效果明显。极差R 显示，对菌种冻存后存活率的影响程度依次为脱脂奶粉＞山梨醇＞海藻糖。脱脂奶粉是一种由蛋白质、乳糖、盐类、维生素类等形成的混合物，由于冻干后的菌粉呈较轻的多孔无定性结构，容易复水[11]，使其在菌种冻存中具有广泛的应用。脱脂奶粉单独作为保护剂时冻干后的存活率较低，一般都是与其他保护剂复配来提高菌种冻干存活率[13]。本文也通过脱脂奶粉与其他保护剂的复配得到了保护效果良好的配方，为可得然胶产生菌株的保藏及工业化生产具有积极的作用。