宫颈高危HPV持续感染者脱落细胞中LncRNA NEAT1和HOTAIR的表达及临床意义

周 薇 代爱霞

上海市宝山区大场医院(200436)

研究已证实，高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染与宫颈癌密切相关[1]。80%的妇女一生中会感染HPV，只有少部分患者出现HPV持续感染，甚至出现宫颈上皮病变、宫颈癌等严重病理变化[2]。大部分宫颈癌变原因是HPV持续感染[3]。目前宫颈癌癌前检查主要通过宫颈脱落细胞学检测或联合HPV DNA检测，但单次检测结果不能代表HPV持续感染。长链非编码RNA(LncRNA)是一类RNA分子，参与肿瘤细胞内多种信号过程[4]。HOX转录反义RNA(HOTAIR)是长度为2158nt的LncRNA，与胰腺癌、肝癌、宫颈癌等发生发展相关[5]。LncRNA核富集转录体(NEAT1)在多种恶性肿瘤中表达异常[6]。但关于LncRNA NEAT1和HOTAIR在宫颈HPV持续感染研究鲜有报道。故本研究检测宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中LncRNA NEAT1和HOTAIR的表达水平，为临床早期诊断提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年8月-2018年8月本院确诊并治疗的宫颈高危型HPV感染患者56例。纳入标准：①经临床诊断证实为HPV持续感染；②未经任何手术、药物治疗；③能按期随访，具有完整临床资料；④医院伦理委员会批准，患者知情同意。排除标准：①既往无宫颈上皮内瘤、宫颈癌和其他恶性肿瘤；②年龄>60岁。

1.2 标本处理

使用采样刷收集患者宫颈脱落细胞标本，行液基薄层细胞学检查(TCT)和HPV DNA基因型检测。细胞部分用于4%甲醛溶液固定，离心、浓缩后涂片，用于p16、Ki67检测；部分于HPV DNA检测的保存液中保存；部分-80℃冻存。

1.3 HPV DNA基因型检测

取保存液样本500μl离心，提取DNA，PCR扩增体系PCR反应试剂及Tap酶加入试管中，DNA模板1 L，振荡混匀离心行PCR扩增；同时分别扩增HPV18型阳性对照和阴性对照以做参照。采用凯普医用核酸分子快速倒流仪进行导流杂交，酶标显色，检测扩增HPV产物的基因分型。结果判定：阳性点可见蓝紫色的圆点，根据HPV膜条分型分布图判定HPV病毒类型。本研究检测显示14种高危亚型：68、66、58、33、16、18、31、51、39、45、52、59、53、56，5种低危亚型6、11、44、43。

1.4 免疫组织化学检测p16、Ki67

涂片经3% H2O2溶液室温孵育10min，阻滞内源H2O2酶活性，10mmol/L(pH8.0)缓冲液清洗；90℃水浴30min抗原热修复；滴加p16、Ki67单克隆抗体(1:500)，4℃孵育过夜，PBS洗3×5min；洗涤后滴加酶标二抗37℃孵育30 min，PBS洗3×5min；滴加DAB显色。p16定位于胞质和胞核，染色棕黄色为阳性；Ki67定位于胞核，胞核棕黄色为阳性。脱落宫颈细胞着色>10%即判定为阳性标本。

1.5 qRT-PCR检测LncRNA NEAT1和HOTAIR

取冻存的细胞标本提取细胞中总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度，将良好的RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR检测LncRNA NEAT1和HOTAIR相对表达量，在冰上配置PCR反应液，反应体系为25 μl：SYBR GreenⅡqPCR Master Mix 12 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 10 μl，振荡离心充分混匀PCR反应液；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。采用3步法设定反应程序为：95℃ 10 min；95℃ 15 s；48℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环。PCR反应结束后收集数据，对Ct值进行分析，LncRNA NEAT1和HOTAIR以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt算法计算LncRNA NEAT1和HOTAIR的相对表达量。

表1 引物信息

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较

根据HPV检测持续感染组26例、转归组30例，两组一般资料比较无差异(P>0.05)，见表2。

表2 两组患者一般资料比较

2.2 脱落细胞检测指标

宫颈HPV感染患者中脱落细胞LncRNA NEAT1、HOTAIR表达水平持续感染组表达高于转归组(P<0.05)。见图1。免疫组化检测p16、Ki67表达阳性率持续感染组(73.3%、66.7%)高于转归组(19.2%、11.5%)(χ2=16.329、17.490，均P=0.000)。

图1 宫颈脱落细胞中相对表达量

2.3 p16、Ki67与LncRNA NEAT1、HOTAIR相关性

Spearman相关性分析显示，LncRNA NEAT1、LncRNA HOTAIR表达与p16、Ki67均呈显著正相关。见表3。

表3 各指标相关性分析

2.4 LncRNA NEAT1和HOTAIR诊断宫颈HPV持续感染价值

ROC曲线分析显示，LncRNA NEAT1诊断宫颈HPV持续感染的特异性为95.7%，敏感性为60.0%；LncRNA HOTAIR诊断宫颈HPV持续感染的特异性为84.6%，敏感性为90.0%。具体见表4、图2。

表4 两种指标诊断宫颈HPV持续感染分析

图2 两种指标诊断HPV持续感染AUC曲线分析

3 讨论

宫颈癌患者多数是由癌前病变-子宫颈上皮内瘤逐渐发展而来，发病与HPV持续感染关系密切[7]，早期诊断HPV持续感染可降低发生宫颈癌风险。目前对宫颈HPV持续感染主要是宫颈脱落细胞学检测或HPV DNA检测，但单次检测结果难以确定感染状态，选择宫颈HPV持续感染的特异性标识物具有临床意义。

LncRNA在多种肿瘤病理变化中发挥重要作用。一些相关研究显示，LncRNA NEAT1是非编码RNA，属细胞核内旁斑的重要组成部分[8]；在乳腺癌患者中异常高表达，且与淋巴结转移和肿瘤大小密切相关[9]；在卵巢癌表达高于癌旁组织，且与肿瘤分级、FIGO分期、淋巴结转移等密切相关[10]；在宫颈组织表达量随着宫颈病变程度增加而增高，宫颈癌表达高于宫颈炎和宫颈上皮内瘤样病变组织，提示NEAT1参与了从早期炎症到晚期癌变的全过程[11]。高危HPV持续感染与宫颈癌发生关系密切，但NEAT1表达与HPV感染的关系鲜有报道。本研究结果显示，宫颈HPV持续感染组脱落细胞中LncRNA NEAT1水平高于转归组，提示LncRNA NEAT1可能参与了HPV持续感染的过程。有研究报道miRNA-34a在宫颈HPV持续感染组中表达显著升高，可作为HPV感染转归的新指标[12]。而生物信息学分析显示miRNA-34a是LncRNA NEAT1的靶基因，推测LncRNA NEAT1可能通过参与调控miRNA-34a表达参与宫颈HPV持续感染及后续癌变过程。ROC曲线分析显示，LncRNA NEAT1诊断宫颈HPV持续感染的AUC面积是0.838，有望作为宫颈HPV持续感染的潜在早期诊断指标之一。

LncRNA HOTAIR是第一个被发现的反式转录调控LncRNA，通过调节血管内皮生长因子(VEGF)表达影响上皮间质转化，促进宫颈癌的发生发展。薛世民等研究报道，非小细胞癌患者中LncRNA HOTAIR异常高表达，且与患者临床分期及预后等密切相关[13]。Geng等报道干扰肝癌细胞中LncRNA HOTAIR的表达，VEGF和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达减少，是多种肿瘤早期诊断标志物[14]。本研究显示，宫颈HPV持续感染组LncRNA HOTAIR表达水平高于转归组，提示其可能与HPV持续感染有关。ROC曲线分析显示，LncRNA HOTAIR诊断宫颈HPV持续感染的AUC面积是0.936，有望成为宫颈HPV持续感染的早期预测指标。

p16可通过突变、缺失引起细胞周期紊乱，引发细胞癌变。在多数肿瘤组织中出现基因缺失，表达降低，但在宫颈癌中表达不同[15]。HPV E7蛋白与pRb结合，解除pRb对p16蛋白表达的负调控，引起p16表达升高[16]。p16高表达与宫颈癌临床分期、分化程度密切相关[17]。Ki67可反映宫颈癌细胞增殖情况[18]。当p16、Ki67均高表达时提示机体细胞周期异常，二者常作为宫颈癌早期诊断的敏感性标志物。本研究结果显示p16、Ki67在HPV持续感染组中阳性表达率升高。Spearman相关性分析显示，LncRNA NEAT1、HOTAIR与p16、Ki67呈显著正相关，提示二者可能与宫颈癌前期HPV持续感染有关；LncRNA NEAT1、HOTAIR在HPV持续感染患者中均高表达，而宫颈癌发病大多数与HPV持续感染相关，提示可通过检测宫颈脱落细胞中LncRNA NEAT1、HOTAIR早期预防。

综上所述LncRNA NEAT1、HOTAIR在宫颈HPV持续感染患者脱落细胞中异常高表达，可能成为宫颈HPV持续感染的临床诊断指标，预防宫颈癌变。但本研究样本量不足，仅提供一种思路，还需扩大样本探究其作用机制。