数据挖掘技术在雌激素对心血管的分子调控网络中的应用

2020-08-07李艳红杨亚莉陈芬万翔龚芳

安徽医药 2020年8期

李艳红，杨亚莉，陈芬，万翔，龚芳

作者单位：1长江大学附属仙桃市第一人民医院，a心电图室，b心内科，湖北仙桃433000；2华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科，湖北武汉430022；3襄阳市中心医院，湖北文理学院附属医院心内科，湖北襄阳441021

心血管疾病（cardiovascular diseases，CVDs）是世界范围内常见的高病死率疾病，严重威胁人们的生命健康［1］。与男性相比，女性病人的发病年龄虽然较晚，但病死率及并发症的发生率均高于男性［2］。流行病学研究发现绝经前女性心血管疾病发病率较低，绝经后明显增高，这是由于女性体内的雌激素可以影响血脂代谢，对心血管系统具有一定的保护作用［3-4］。此外，有研究指出在时间窗口期应用雌激素对心血管系统具有保护作用。但是，也有研究［5-6］发现应用口服雌孕激素替代治疗对心血管并没有保护作用。因此，关于雌激素对心血管系统的作用引起广泛的关注，成为目前研究的热点。本研究2019年1—3月通过筛选雌激素作用后的差异基因，进一步明确雌激素在心血管系统中的调控靶点及作用网络，从而为进一步明确雌激素在心血管系统中的作用提供方向。

1 资料与方法

1.1数据检索通过NCBIGEODatasets检索雌激素在心血管中的相关研究，筛选出GSE9371数据集［7］。该数据来源于美国波士顿大学生物部门Hansens实验室，研究者将小鼠分为安慰剂组与雌激素组，每组5个重复，在接受长期（1周）的雌激素治疗后，提取了小鼠主动脉组织中的总RNA进行了基因表达谱分析，以确定长期雌激素治疗对综合基因组的表达的调控。样本数据信息见表1。

表1 雌激素在心血管中的相关研究GSE9371数据样本信息

1.2差异表达基因分析采用NCBIGEO2R在线分析工具［8］进行差异表达基因的分析，以安慰剂组为对照组，雌激素组为干预组。将差异表达倍数大于2倍，同时P＜0.05的基因筛选为差异表达基因。

1.3 GO富集分析及作图采用DAVID 6.8从生物学过程，细胞组分和分子功能三个方面进行GO富集分析［9］，以P＜0.05筛选为差异有统计学意义的GO富集结果。采用R语言ggplot2程序包进行可视化绘图。

1.4通路富集分析及作图采用DAVID 6.8在REACTOME，BIOCARTA，KEGG_pathway三个通路数据库中进行KEGG富集分析［9］，以P＜0.05筛选为差异有统计学意义的通路富集结果。采用R语言ggplot2程序包进行可视化绘图［10］。

1.5蛋白质相互作用网络分析采用STRING数据库［11］对筛选出的差异基因进行蛋白质相互作用的分析，隐藏不存在相互作用的节点，最小相互作用证据评分设置为0.4分。此外，采用R语言统计与其它蛋白相互作用关系最多的节点，取前30个进行可视化作图。采用Cytoscape中的MCODE算法分析［12］，提取其中的核心基因模块，同样利用DAVID 6.8对核心模块基因进行GO富集分析及通路富集分析。

2 结果

2.1差异表达基因的分析将雌激素组与安慰剂组基因表达水平进行比较，按照差异表达倍数大于2倍，同时P＜0.05进行差异表达基因的筛选，共筛选到差异表达基因192个，按照P值排序，其中前10位的基因为 Grem2、Ano4、Mmd2、Apod、Galnt15、Heph、Vldlr、Stc1、Vwf和Zmiz1，均为上调表达（表2）。

表2 雌激素在心血管中的相关研究中雌激素组与安慰剂组前10位差异表达基因

2.2基因功能富集分析基因功能富集分析将上述192个差异基因映射到生物学过程，细胞组分和生物学功能三个基因功能数据库中，以P＜0.05筛选有统计学意义的富集结果，共筛选到100个显著相关的基因功能条目。其中59个（59%）条目与生物学过程有关，涉及脂代谢过程、巨噬细胞活化调控过程、红细胞分化、脂肪细胞分化调控过程、视黄醇代谢过程、血管生成调控、细胞生长调节以及细胞黏附等生物学功能。20个（20%）条目与细胞组分有关，主要与胞外区、细胞外隙、蛋白质的细胞外基质、细胞外外泌体、线粒体等有关。21个（21%）条目与分子功能有关，涉及的分子功能有Wnt蛋白结合、肝素结合、脂质结合、胰岛素样生长因子结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性等有关。按照P值排序，其中前10位的基因功能富集结果条目见图1。

2.3通路富集分析通路富集分析将上述192个差异基因映射到BBID、BIOCARTA和KEGG_pathway三个通路数据库中，以P＜0.05筛选有统计学意义的富集结果，共筛选到13个显著富集的信号通路，分别是乙醇氧化信号通路、PPAR信号通路、脂肪酸降解信号通路、视黄醇类代谢和运输信号通路以及红细胞吸收氧气并释放二氧化碳信号通路等有关，其中前10位的通路富集结果条目见图2。

2.4蛋白质相互作用分析我们采用STRING数据库对192个差异基因进行蛋白质（基因）互作网络分析，结果发现其中131个基因构成了互作网络（图3）。对网络中每个基因的互作基因的个数进行统计后发现，与 Col1a1、Ppargc1a、Cdh2、Ppara、Thbs1等基因存在相互的基因较多，其中前30位的互作基因见图4。随后我们使用MCODE算法进一步提取了其中的核心子网络，结果发现该蛋白质互作网络中有5个核心子网络（图5），对每个核心子网络的基因进行富集分析后发现，核心子网络1主要与细胞外基质、胆固醇平衡、细胞外间隙、内质网以及PPAR信号通路有关。核心子网络2主要与钙调蛋白结合和胰岛素分泌等有关，核心子网络3主要与铁离子平衡和红细胞分化有关，核心子网络4主要与血管新生的调控有关，核心子网络5主要与生长激素受体信号通路和Jak-STAT信号通路有关（表3）。

3 讨论

近年来，我国心血管疾病的发病率及死亡率均持续上升，其死亡率居于首位，同时其在居民死亡的疾病构成中占比达到40%以上，严重威胁居民的生命健康［13］。就性别而言，女性心血管疾病病人的发病年龄虽然较晚，但病死率及并发症的发生率均高于男性［2］。流行病学研究发现雌激素可以影响血脂代谢，对心血管系统具有一定的保护作用［3-4］。既往研究发现雌激素可以通过多种途径保护心血管系统，雌激素可以调节平滑肌细胞的收缩性和基质形成，抑制平滑肌和心肌细胞的凋亡，抑制内质网应激引起的凋亡保护血管内皮细胞［14-16］。但美国妇女健康倡议活动（WHI）研究［6］发现应用口服雌孕激素替代治疗对心血管并没有保护作用，甚至会增加绝经后女性患冠心病的风险。因此，关于雌激素是否可以用于女性心血管疾病的治疗以及雌激素对心血管系统的作用机制引起广泛的关注，成为目前研究的热点。

表3 核心子网络基因功能及通路富集分析结果

本研究通过对GEO数据库的挖掘，分析了雌激素作用后血管总RNA中存在显著差异表达的基因，通过基因功能与通路富集分析，发现这些基因的功能与脂代谢过程、巨噬细胞活化、脂肪细胞分化、血管生成、线粒体、胰岛素样生长因子等有关（图1），涉及的信号通路有乙醇氧化信号通路、PPAR信号通路、脂肪酸降解信号通路等（图2）。说明雌激素可能通过这些基因功能与信号通路影响脂质代谢、血管新生以及细胞生长等生物学功能。蛋白互作网络分析发现，192个差异基因中有131个基因间存在相互作用关系，构成了互作网络（图3）。其中核心的子网络有5个，这些核心子网络的功能主要与细胞外基质、胆固醇平衡、内质网、钙调蛋白、胰岛素分泌、血管新生、生长激素受体信号通路和Jak-STAT信号通路有关（表3）。核心子网络富集到的基因功能与信号通路与所有基因富集后的结果基本一致，更加证明了雌激素可能通过这些基因功能与信号通路对心血管的功能产生影响。对上述雌激素对心血管系统可能的调控途径进一步分析后发现，雌激素可能通过调节脂代谢［3-4］，促进巨噬细胞活化［17］、促进血管内皮细胞生长［18］，激活胰岛素样生长因子［19］，激活PPAR信号通路［20］等途径对心血管发挥保护作用，而其可能通过促进脂肪细胞分化［21］而对心血管产生一定的危害。这些基因功能或信号通路可作为后续进一步研究的方向，从而明确雌激素在心血管系统中的作用。