维生素K 对成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的影响

蒋益忠，夏天爽，辛海量，金玉娥，蒋益萍，薛黎明 （. 浙江省东阳市中医院，浙江 东阳 05；. 海军军医大学药学院生药学教研室，上海 004；. 上海市疾病预防控制中心化学品毒性检定所，上海 006）

维生素K(VK)，又称凝血维生素，是一类具有叶绿醌生物活性的脂溶性维生素。除具有凝血功能外，维生素K 还能促进骨代谢，防治骨质疏松症，天然VK1和VK2(主要活性体为MK4和MK7)可单独或协同其他抗骨质疏松药物治疗骨质疏松症[1-4]，人工合成的VK3也有少量抗骨质疏松研究报道[5-6]，然而，不同维生素K 的抗骨质疏松作用的比较研究非常有限。有研究发现维生素K 具有促进骨形成和抑制骨吸收的双向调节机制[7]，药理研究发现VK1、MK4和MK7能显著促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1 增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性[8]，同时报道VK1、MK4和MK7也能显著抑制RANKL 诱导骨髓单核细胞分化的破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP)基因和组织蛋白酶 K(CTSK)mRNA 表达[9]。临床报道发现VK2能显著降低绝经后骨质疏松的TRAP 和CTSK 表达[10]。CTSK是骨吸收过程中的关键溶骨活性酶[11]，与粘多糖(glycosaminoglycan, GAG)，如 硫 酸 软 骨 素(CSA)，形成一种高分子量的复合物，可将胶原蛋白降解。目前尚未有VK 对CTSK 骨胶原降解的研究报道。本研究以新生大鼠颅盖骨分离成骨细胞和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB 受体活化因子配体(RANKL)诱导骨髓单核细胞的破骨细胞为模型[12]，系统比较VK1、MK4、MK7和VK3对成骨细胞增殖和ALP 活性、破骨细胞分化、TRAP 活性和CTSK 降解胶原活性的影响。通过比较不同VK 抗骨质疏松作用，对临床选用合适的VK 营养补充剂、指导人群VK 膳食补充，以满足我国人群骨健康需求具有重要意义。

1 材料

新生3 d 的SD 大鼠，雌雄不限，购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK（沪）2012-0002]；II 型胶原酶、胰蛋白酶、特级胎牛血清、α-MEM 培养基（美国Gibco 公司）；CellTriter-blue 试剂(美国Promega™)，核刺激因子受体的配体(receptor for activation of nuclear factor kappa B ligand, RANKL，400-30)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF， 400-28)购 自PEPROTECH 公 司， 淋 巴 细 胞 分 离 液Ficoll-Paque 密度梯度液(GE)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；TRACP 染色试剂盒、Benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)购自日本WAKO 公司；L-3-carboxytrans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane(E-64)、硫酸软骨素A (CSA)胃蛋白酶、组织蛋白酶K 抑制剂奥当卡替(odanacatib, ODN)、VK1、MK4、MK7和VK3，购自Sigma 公司；I 型胶原（美国Affymetrix 公司）；牛血清白蛋白、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、多聚甲醛等试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 成骨细胞增殖和ALP 活性

实验室自建原代成骨细胞培养方法[12]。取新生3 d的SD 大鼠5 只，在无菌条件下取其颅顶盖骨，去除骨膜、血管及结缔组织，用D-Hanks 液冲洗干净，用0.25%的胰蛋白酶37 ℃消化30 min，再用0.05%胰蛋白酶及3 mg/ml 的II 型胶原酶37 ℃消化1 h，经100 目滤网过滤，1 000 r/min 离心10 min，即为新鲜的成骨细胞，加入10%胎牛血清的α-MEM 培养基，置37 ℃，5% CO2培养箱。取第四代大鼠颅盖骨成骨细胞，消化分离出来，以α-MEM培养基配制成浓度为2×104/ml 的细胞悬液，以100 μl/孔接种于96 孔培养板，设12 个药物组，分别为1、0.1 和0.01 μmol/L 的VK1、MK4、MK7和VK3，每组选取1 个药物浓度加入1、0.1 和0.01 μmol/L 的VK1、MK4、MK7和VK3，培养48 h，用MTT 法检测细胞增殖活性。ALP 活性需要连续培养6 d 后，用100 μl 50 mmol/L 的二乙醇胺，50 μl 2.5 mmol/L的对硝基苯酚磷酸二钠，37 ℃反应30 min 后，用0.3 mol/L 的NaOH 终止反应，于波长405 nm 处测得吸光度值[12-13]。

2.2 成骨细胞骨结节面积

取成骨细胞第三代细胞，按每孔5×104的细胞数接种于12 孔板内，α-MEM 培养基培养24 h，换骨结节诱导培养基(0.1%BSA，10 nmol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 μg/ml 抗坏血酸以及10%胎牛血清的α-MEM 培养基)，加入1 μmol/L的VK1、MK4、MK7和VK3后，每3 d 换药1 次，连续培养观察14 d 后，用0.1%茜素红-Tris-Hcl 染液(pH 8.3)染色。染色前，用预冷的10%中性甲醛缓冲液固定10 min，PBS 冲洗3 次。加入0.1%茜素红-Tris-Hcl 染液(pH 8.3)，37 ℃下染色30 min。蒸馏水冲洗，干燥，封片。倒置相差显微镜(Leica DMI 3000)下进行观察并随机拍照10 张，用image-Pro Plus (IPP 6.0)分析图片，得出每张图片骨结节面积[13]。

2.3 破骨细胞活力和数目

取新生3 d 的SD 大鼠胫骨，用α-MEM 培养基冲洗骨髓腔以收集骨髓细胞，加入等量Ficoll 试剂分离骨髓单核细胞，用含有25 ng/ml M-CSF、25 ng/ml RANKL 的细胞因子和10%胎牛血清的α-MEM 培养基进行培养，每3 d 换液1 次，6 d 后破骨细胞分化成熟。细胞成熟后，以1×105/ml 接种于96 孔板，加入1、0.1 和0.01 μmol/L 的VK1、MK4、MK7和VK3。继续培养48 h 后，取100 μl 培养基，加入20 μl CellTriter-blue 试剂，轻轻晃10 s 混匀，37 ℃孵育30 min 后，将96 孔板置于荧光分光光度计，检测细胞悬液荧光强度(发散光波长560 nm，吸收光波长590 nm)。

2.4 破骨细胞TRAP 活性

成熟破骨细胞以1×105/ml 接种于96 孔板内，加入1、0.1 和0.01 μmol/L 的VK1、MK4、MK7和VK3，培养48 h 后，弃上清液，PBS 冲洗2 次，20 μl 0.1%Triton X-100 室温破碎细胞15 min，加入100 μl反应液(0.4 g 对硝基苯基磷酸二钠，去离子水溶解后加入2.0 g 酒石酸钾钠，加水溶解至150 ml，HCl 调节pH 至3.5，再加水定容至200 ml)，于37 ℃反应30 min，迅速加入100 μl 1 mol/L 的NaOH 终止反应，于波长405 nm 处测定其吸光度值[14]。

2.5 抑制CTSK 与Z-FR-MCA 底物

25 μmol/L 的VK1、MK4、MK7、VK3和1 μmol/L阳性药Odanacatib 用100 mmol/L 醋酸钠缓冲液(pH5.5， 包 含 2.5 mmol/L DTT， 和 2.5 mmol/L EDTA)稀释至浓度为25 μmol/L 加入96 孔板，最终反应容量为0.2 ml，加入终浓度为5 nmol/L 的CTSK 孵育5 min，加入5 μl 底物1 mmol/L 的ZFR-MCA 溶液开始反应，检测5 min 荧光信号(发散光波长460 nm，吸收光波长355 nm)。实验设阴性对照，阳性对照(1 μmol/L E-64)。

计算公式：抑制率（%）=100-(1-Vi/V0)。

Vi和V0分别表示存在和不存在VK 情况下，记录荧光信号强度随时间变化斜率slope 值[11]。

2.6 凝胶电泳法检测CTSK 降解可溶性胶原

可溶性I 型胶原溶解在100 mmol/L 醋酸钠缓冲液(pH5.5，包含2.5 mmol/L DTT 和2.5 mmol/L EDTA)，最终I 型胶原浓度为0.6 mg/ml，加入终浓度100 μmol/L 的VK1、MK4、MK7和VK3及10 μmol/L阳性对照药Odanacatib，依次将CTSK 和CSA(终浓度分别为400 和200 nmol/L)加入含有I 型胶原蛋白的反应液中，使总反应液容量为50 μl。混匀，28 ℃孵 育4 h，取 出 后 加 入1 μl 的100 μmol/L E64 终止反应。采用10%的SDS-PAGE 凝胶电泳分离，卡马斯亮蓝染色20 min，用乙酸-甲醇(4∶1)脱色。I 型胶原的α1 条带的灰度用Gene Snap(Syngene Inc.Frederick，MD)软件进行定量分析[14]。

2.7 统计学分析

每组实验重复3 次。采用SPSS 软件经ANOVA方差分析检验(α=0.05)，再用SNK 对每两组进行两两比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 维生素K 对成骨细胞增殖、ALP 活性和骨结节形成的影响

VK1和VK3在0.01～1 μmol/L 浓度范围内对成骨细胞增殖和ALP 活性均未有影响(图1A、1B)。MK4在0.01 和0.1 μmol/L 浓度显著促进了成骨细胞增殖活性，分别提高了15.5%和23.0%(P＜0.05)，而MK7分别提高了25.1%和18.4%。MK4和MK7在1 μmol/L 显著提高了ALP 活性(P＜0.05)，促进率分别为30.2%和25.7%。成骨细胞在骨结节诱导培养基培养14 d 后，经茜素红染色液染色，骨结节处形成红色钙化晶体，骨结节的面积代表了成骨细胞的钙化程度(图1C)，结果显示MK4和MK7在1 μmol/L 浓度时显著提高了骨结节形成面积(P＜0.05)，分别增加25.2%和34.0%，VK3显著抑制了骨结节的形成。

3.2 维生素K 对破骨细胞活力和TRAP 活性的影响

由 图2A 可 得，VK1、VK3、MK4和MK7在0.01～1 μmol/L 浓度对破骨细胞代谢活力均无影响，对破骨细胞无毒性。VK1、MK4和MK7在1 μmol/L 表现出抑制TRAP 活性，抑制率分别为27.4%、54.0%和35.0%，MK4在0.01 和0.11 μmol/L浓度显著降低了破骨细胞TRAP 活性(P＜0.01)，分别降低了50%和41%，MK7在0.1 μmol/L 浓度时，TRAP 活性显著降低26.8%(图2B)。

3.3 维生素K 对CTSK 酶的抑制作用

本研究考察VK1、VK3、MK4和MK7抑制CTSK 与Z-FR-MCA 底物结合活性。图3A 结果显示，1 μmol/L 的ODN 抑制了CTSK 与Z-FRMCA 底 物 结 合 效 率 达98.3%，而25 μmol/L 的VK3、MK4、MK7和VK1抑 制 率 分 别 为0.3%、58.9%、16.6%和9.4%。与空白胶原相比，VK3、MK4、MK7和VK1在100 μmol/L 抑制胶原降解效率达30.8%、73.8%、18.4%和19.2% (图3B、3C)，仅有MK4和ODN 超过60%的抑制率，与未加CSA 的CTSK 阴性对比，抑制率达38.8%、93.0%、23.1%和24.2%。与空白胶原组对比，阳性抑制剂ODN 在1 μmol/L 的 抑 制 率 达77.3%，与 未 加CSA 的CTSK 阴性对比，抑制率达到99.0%。

4 讨论

研究报道VK1、MK4和MK7能显著促进成骨细胞活性和抑制破骨细胞活性[9-10]。临床报道服用高含量维生素K1能够降低髋部骨折风险和提高髋部及腰椎部骨密度，可延缓50～60 岁绝经后女性的骨丢失[2]。同时药理研究发现VK3显著促进去卵巢大鼠的骨密度和改善骨质疏松相关指标[5]。而本研究并未发现VK1和VK3具有促进成骨细胞和抑制破骨细胞的作用，可能原因是选择的筛选浓度过低所致。MK4和MK7在1 μmol/L 能促进成骨细胞增殖和矿化作用，二者并没有显著差异。但在抑制骨吸收作用方面，MK4相较于MK7在相同浓度，有更显著的抑制TRAP 活性的作用。

CTSK 是破骨细胞发挥骨吸收作用的关键靶标酶，选择性地大量表达于破骨细胞，其生理作用底物正是在有机骨基质中含量达95%的I 型胶原[11]。我们研究发现，在相同浓度，只有MK4能显著抑制其底物骨胶原降解和人工合成底物Z-FR-MCA 的活性。

日本早在1995 年首次将MK4作为治疗骨质疏松的药物应用[15]，2011 年MK4录入我国《原发性骨质疏松症诊疗指南》[16]。因此，我们认为MK4是人体内源性营养物质，安全性高，适用于各年龄人群作为营养补充剂使用。MK7具有促进骨形成作用，在体内也可以分解成MK4发挥作用，适合作为营养食品补充剂。