体外敲降转录因子BCL11A对胚胎神经元特异性因子的影响

许 贞，李淑蓉，苏炳银△，解学敏△

1.成都医学院 人体解剖与组织胚胎学教研室(成都 610500)；2.发育与再生四川省重点实验室(成都 610500)；3.成都医学院 病理与病理生理学教研室(成都 610500)

智力障碍(intellectual disability, ID)是一类具有广泛遗传异质性的神经系统疾病。在遗传因素引起的智力障碍中，其中2号染色体p15至p16.1片段缺失型智力障碍是一类特异的ID亚型。BCL11A(B-Cell CLL/Lymphoma 11A，BCL11A/Ctip1)是具有锌指结构的转录因子，其基因位于人类染色体2p16.1。在大脑皮层发育过程中，BCL11A对深层皮质中的投射神经元亚型形成发挥重要作用，与皮层发育的关键因子TBR1共定位在皮质层的第5层，抑制TBR1的表达可调节神经元发育过程中的重要基因网络[1-2]。BCL11A在胚胎发育过程中对皮质神经元的调控作用鲜有研究。本研究旨在探讨BCL11A对胚胎神经元特异转录因子的调控机制，为BCL11A缺失所致2p15-16.1缺失型智力障碍的发生机制提供新线索。

1 材料与方法

1.1 细胞及胎鼠

293T细胞系(人肾上皮细胞系)来源于人胚肾细胞、SH-SY5Y细胞系(人神经母细胞瘤细胞系)来源于人神经母细胞。野生型C57/BL6小鼠购自成都达硕实验动物公司。将野生型雄性及雌性成熟小鼠饲养于同一笼中进行配种，检栓并计算孕龄，获取胚胎11.5、13.5、15.5、18.5 d胎脑组织及出生后7 d小鼠大脑。

1.2 试剂及主要设备

免疫印迹技术(Western blot)全套试剂、RIPA、蛋白酶抑制剂(PMSF)购自上海碧云天公司，TRIZOL Reagent购自美国英杰生物有限公司，AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，anti-Ctip1 antibody、anti-β-actin antibody购自上海艾博抗公司。二氧化碳细胞培养箱购自美国Thermo公司，电泳及凝胶成像系统、PCR仪及CFX96Tm Real-time system购自美国Bio-Rad公司，正置荧光显微镜、激光共聚焦显微镜购自日本Olympus公司，冰冻切片机购自美国Thermo公司。

1.3 RT-qPCR 检测目的基因表达

利用Trizol提取成年雄性小鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉、骨髓、大脑皮层，胚胎13.5、18.5 d胎脑组织及出生后7 d小鼠大脑，转染siRNAs 48 h的293T细胞、SH-SY5Y细胞的总RNA。利用TransScript All-in-One First-Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒得到cDNA，参照试剂盒说明书步骤操作。以cDNA为模版应用实时荧光定量PCR检测目的基因表达情况。设计相关引物序列见下表(表1)。

表1 相关的引物序列

1.4 Western blot检测BCL11A蛋白表达

提取成年雄性小鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉、骨髓、大脑皮层及胚胎11.5、13.5、15.5、17.5 d胎脑组织蛋白，配置浓度10% SDS-PAGE分离胶、5%SDS-PAGE浓缩胶，电泳电压60～120 V。转膜结束后，将携有蛋白的PVDF膜浸于5%脱脂奶粉中室温封闭1 h。1∶2 000(anti-Ctip1、anti-β-actin)稀释一抗，4 ℃摇床孵育过夜。次日选取对应二抗进行室温孵育； TBS-T将膜浸洗3次后加入显色液，置于Bio-Rad成像系统进行拍摄，使用Image LabTM及Image J软件进行分析。

1.5 免疫荧光检测胚胎13.5 d BCL11A组织分布

PBS浸泡胚胎13.5 d小鼠大脑皮层冰冻切片(-20 ℃保存)至室温。 4%PFA(多聚甲醛)室温固定10 min。PBS漂洗3次后以Tritonx-100(0.5%)滴于组织区域，10～20 min后用PBS漂洗3次。进口胎牛血清滴加于组织区域，室温封闭30 min。稀释并滴加一抗(anti-Ctip1 antibody，1∶200稀释)，4 ℃冰箱湿孵过夜。次日，PBS漂洗并孵育二抗：每组织区域滴加20 μL二抗(1∶400稀释)，避光室温孵育2 h后避光漂洗，滴加10 μL含DAPI的封片剂于组织区域，封片。利用正置荧光显微镜观察，并使用激光共聚焦显微镜进行拍照。

1.6 细胞培养

将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y培养于含1%双抗、10%FBS(胎牛血清)、DMEM/F12培养基中，置于37 ℃、5%CO2、95%湿度的恒温培养箱中培养,待细胞融合度为80%～90%或2～3 d后传代。细胞转染操作前1 d，将SH-SY5Y细胞接种于24孔培养板中，接种密度以细胞密度达70%～80%为宜。

1.7 细胞转染

按照TransIntroTMEL Transfection Reagent说明书操作。在24 孔板中培养SH-SY5Y细胞，使转染时细胞融合度达70%；转染前4 h更换无血清培养基。准备转染复合体：用Opti-MEM稀释siRNA干扰试剂，混匀；用Opti-MEM稀释TransIntroTMEL Transfection Reagent，混匀；分别室温放置5 min 后，混合步骤a和b两个体系。轻轻混匀后室温放置20 min。在24孔板中加入转染复合体，轻轻混匀。 在37 ℃、5% CO2的培养箱中转染4～6 h后可换含血清的培养基。继续在上述培养箱中培养48 h后，收集细胞。

1.8 染色质免疫共沉淀分析神经元特异性因子的启动子活性

在细胞悬浮培养基中，加入甲醛(终浓度1%)固定，加入甘氨酸终止反应，PBS清洗后，离心收集固定好的细胞，重悬细胞放冰上15 min，用PBS漂洗，用核制备缓冲液Ⅰ、Ⅱ重悬细胞，在冰上静置10 min，中途涡旋震荡两次，离心后加入裂解液后剧烈涡旋，冰上静置30 min。用超声波破碎仪使染色质碎裂。加入超声裂解液、RNase A，37 ℃恒温箱静置2 h，加入5 mol/L NaCl 4 μL、20 μg蛋白酶K。第2天用配好的有机溶液(酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1)抽提DNA，取样品进行电泳检测。蛋白提取物中加Invitrogen®Protein A /Protein G Dynabeads，加入H3K4me3、H3K27me3抗体和BSA，再分别加入特异抗体和同种属IgG，摇床上低温过夜。在Protein A Dynabeads/Protein G Dynabeads中加入IP细胞裂解液和BSA,4 ℃冰箱孵育12 h。离心去掉上清。加入Protein A Dynabeads/Protein G Dynabeads, 低温摇床处理2～3 h。低温离心后弃上清，在沉淀中加入现配置的ChIP提取液，摇床上放置30 min，离心转移到新的离心管。ChIP提取液和输入样品中，加入RNase A，37 ℃ 恒温箱放置2 h。再加入NaCl与蛋白酶K混匀，65 ℃水浴裂解过夜。第2天抽提并纯化DNA，再进行PCR反应，最后进行qPCR定量分析。空白对照组及实验组分别进行3次独立重复实验，相关表达水平以2-ΔΔCT值计算。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 BCL11A在成年小鼠各器官组织及不同时期胎鼠大脑组织中的表达

结合课题组前期针对ENCODE来源基因芯片和GTEx数据进行了人源BCL11A表达谱分析，为进一步探索BCL11A在小鼠各器官组织中的表达情况，本实验利用实时定量PCR检测BCL11A在胚胎13.5 d胎鼠脑组织及成鼠各主要器官组织中的表达量。qPCR结果显示BCL11A主要表达于胚胎13.5 d的胎鼠大脑、成年小鼠的骨髓、大脑皮层、脾脏、肺组织中，此结果与课题组前期所分析BCL11A在人类各器官组织表达谱相符(图1)。

为探索BCL11A在小鼠胎脑发育过程中的动态表达变化，实验选取胚胎13.5 d、胚胎18.5 d、出生7 d的小鼠大脑及成年小鼠大脑皮层进行定量分析，结果显示小鼠胚胎发育关键时期胚胎13.5 d的胚脑中BCL11A表达量最高，胚胎18.5 d时表达相对下降，而出生后7 d和成年小鼠的大脑皮层，BCL11A表达量较胚胎发育时期明显降低，提示BCL11A在胚胎皮质神经元发育的关键时期具有重要调控作用(图2)。

2.2 Western blot检测小鼠各器官组织及早期发育阶段中BCL11A的表达

Western blot结果表明BCL11A在成年小鼠的大脑皮层、脾脏、肺中均有表达，且脾脏和大脑皮层的表达量较高，而在心脏、肝、肾脏、肌肉及骨髓中未表达，其蛋白水平与qPCR的结果相吻合。胚胎发育阶段4个关键时间节点胚胎11.5、13.5、15.5、17.5 d中，BCL11A蛋白水平在胚胎13.5 d的胚脑达到最高，进一步提示在皮层神经元发育的关键时期胚胎13.5 d，BCL11A参与调控重要的神经元发育相关事件(图3、4)。

2.3 在293T细胞中验证siRNA的干扰效率

针对人源BCL11A的mRNA序列设计3组siRNA，并在人胚肾上皮293T细胞中分别转染siRNA418、siRNA914、siRNA1132，收集细胞总RNA并反转录为cDNA，qPCR检测BCL11A基因mRNA的表达变化。与对照组siGFP相比，转入siRNA418、siRNA914及siRNA1132的细胞中BCL11A 的mRNA表达量明显下降(P<0.001)，siRNA418中相对对照组，BCL11A表达量为(27.64±2.58)%，siRNA914中BCL11A基因RNA的表达量相对siGFP组为(49.32±4.12)%，siRNA1132中BCL11A基因RNA的表达量相对siGFP降至(21.28±1.23)%，3组siRNA均能有效降低目的细胞中BCL11A的mRNA水平(图5)。

2.4 BCL11A在胚胎13.5 d胎鼠大脑皮层的表达

为进一步明确BCL11A在小鼠大脑的亚定位，选取其蛋白表达水平最高的时期，即胚胎13.5 d。取该时期小鼠胎脑进行BCL11A的免疫荧光实验，并同时标记神经元特异性因子NeuN。免疫荧光染色检测发现，BCL11A在小鼠胚胎神经元发育的关键时期胚胎13.5 d呈现阳性表达，并主要分布于该时期胚脑皮层区域，并与神经元特异性标志物NeuN具有相似表达与分布特性(图6)。

2.5 siRNA干扰BCL11A的表达导致关键转录因子表达下降

将干扰效率最优的两组siRNA(siRNA418和siRNA1132)分别转染进293T细胞48 h后，检测神经元特异转录因子的转录水平变化，发现BCL11A的表达降低致使皮质神经元发育关键基因Sox6、Tbr2、NeuroD2表达量明显下降，提示BCL11A对于皮质神经元关键转录因子的表达具有正向调控作用(图7)。

2.6 SH-SY5Y中BCL11A敲降后重要转录因子启动子染色质活性改变

利用染色质免疫共沉淀(ChIP)实验初步考察BCL11A受干扰情况下，人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中皮层发育关键基因的启动子染色质活性变化。结果表明，在SH-SY5Y细胞中敲降BCL11A的表达，神经元前体细胞关键因子Sox6、Tbr2神经元关键因子NeuroD2的启动子区域活性染色质修饰H3K4me3富集程度明显降低。启动子抑制性染色质修饰H3K27me3富集程度明显增加。与此同时，胶质细胞与放射状胶质细胞的关键基因GFAP、BLBP启动子位点的染色质修饰无明显变化(图8～9)。

3 讨论

BCL11A在大脑皮层投射神经元的发育过程中至关重要。BCL11A/Ctip1通过调节深层投射神经元亚型的特异性来精确控制新皮层的发育[3]。研究[4]证实了仅BCL11A基因的单倍体剂量不足就足以引起神经发育缺陷，BCL11A的突变会导致独特的ID综合征。目前已报道的2p15-16.1缺失型智力障碍的15个病例是由于其基因组2p15-16.1不同类型片段缺失而出现不同程度的智力发育延缓，畸形特征及微颅畸形特征[5-6]。深度解读发育障碍研究计划也揭示位于部分智力障碍患者中的 BCL11A 位点的错意突变(MIM: 606557)与智力障碍的发生高度关联[7-9]。

BCL11A作为核内转录因子，不仅在神经系统具有重要功能，在淋巴系统的发育、血液胎儿型珠蛋白正常表达亦具有重要的调控作用。BCL11A能够在红系祖细胞内募集重要的转录因子以调控下游红系特异性转录因子的表达，在转录水平参与调控红细胞的正常分化与形成[10]。

本课题通过qRT-PCR和Western blot方法发现并经免疫荧光证实BCL11A主要表达在小鼠胚胎13.5 d的胎鼠大脑皮层神经元。结合BCL11A在人类及小鼠的表达谱及胚胎发育关键时期胚胎13.5 d BCL11A的阳性表达，可以推论BCL11A在胚胎皮层发育时期发挥了重要作用。为初步探究其调控机制，课题组通过ChIP实验发现在SH-SY5Y细胞中BCL11A表达降低的情况下，神经元前体细胞关键基因Sox6、Tbr2神经元关键基因NeuroD2的启动子活性染色质修饰H3K4me3和抑制性染色质修饰H3K27me3富集程度出现了明显改变。

既往研究[11]表明Sox6是非胆碱能皮层投射神经元的重要分类标记；Tbr2作为中间祖细胞标志物，可以增强小鼠皮质的神经发生，调节兴奋性神经元的精细尺度空间和电路组织。NeuroD2有助于皮质细胞迁移的最终定位；结合ChIP实验结果在BCL11A敲降的情况下，这3种大脑皮质形成的关键基因表达均明显下降，这表明在皮质形成的过程中BCL11A可能对这3种基因起到了正向调节作用，结合BCL11A在皮层发育中的调节作用，可以推论BCL11A和其他神经元关键因子一起参加到皮质形成的重要环节，并与智力发育有着密切联系。而相关的分子机制还有待进一步实验证实。

综上所述，BCL11A对于胚胎神经元发育的具体功能及作为转录因子参与皮层发育的具体分子机制仍有待进一步研究。完善BCL11A在皮层发育中的相关研究对于研究和诊治智力障碍至关重要。