舒芬太尼后处理通过ERK1/2介导的p70S6K信号通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

闻 颖，吴巧玲，刘国利

(1.锦州医科大学研究生学院，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学附属第一医院麻醉科，辽宁 锦州 121000)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指由缺血和恢复进入先前缺血组织的血流引起的对心肌的损伤。再灌注后，心肌超微结构、功能、代谢和电生理特征进一步受损，出现血压突然下降、心率下降甚至猝死[1-2]。 MIRI可对心肌细胞造成不可逆的损伤，并降低细胞活性。 目前公认MIRI的主要机制包括释放过量的钙、释放炎症因子和细胞凋亡[3]。已有研究[4-8]证实：MIRI诱导细胞凋亡是急性MIRI的主要形式。目前，已经鉴定出3种调节细胞凋亡的信号转导途径，包括线粒体途径、死亡受体途径和内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途径[9]。

促活化激酶信号级联途径包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)和细胞外信号激酶1/2(extracellular-signal regulated kinase，ERK1/2)，在缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/R)过程中该途径被激活，可以保护心脏免受再灌注损伤[10]。p70核糖体蛋白S6激酶(p70 ribosomal protein S6 kinase,p70S6K) 是一种属于环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)依赖性蛋白激酶家族的激酶[11]，在多种细胞过程中发挥重要作用，包括蛋白质合成、mRNA加工、葡萄糖稳态、细胞生长和存活[12]。p70S6K 作为ERK信号通路的下游靶点，控制着翻译元件的生物合成，参与蛋白质合成[13]。

舒芬太尼(sufentanil，Sufen)是一种特异性的μ-阿片受体激动剂，具有强大的脂溶性和对人体血浆蛋白的高附着率，具有强大的镇痛作用，常用于心脏手术患者。研究[14]显示:舒芬太尼在I/R心肌损害中发挥重要作用，但是目前有关ERK1/2介导的p70S6K 信号通路对大鼠I/R的保护机制研究较少。本研究通过构建大鼠MIRI模型，探讨舒芬太尼对大鼠MIRI的保护作用机制，为临床应用舒芬太尼提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器SPF级SD雄性大鼠72只，体质量200～250 g，由锦州医科大学动物部提供，动物生产许可证号：SCXK(京)2014-0010，在温度(20±2)℃、相对湿度(55±5)%条件下饲养。所有实验动物在实验过程中严格遵循实验动物的护理和使用指南。舒芬太尼注射液(宜昌人福药业有限责任公司)，戊巴比妥钠(上海泰瑞尔生物技术有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)和ERK抑制剂PD98059(美国Sigma 公司)，磷酸化ERK(p-ERK)小鼠多克隆抗体和磷酸化p70S6K(p-p70S6K)小鼠多克隆抗体(美国Cell Signaling公司)，HRP标记山羊抗小鼠二抗(江苏碧云天生物技术研究所)。ALC-v8d动物呼吸机(上海奥尔科特有限公司)，监护仪M3046A(美国Philips公司)。

1.2 大鼠MIRI模型的制备大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠50 mg·kg-1麻醉及500 U·kg-1肝素化后，取仰卧位固定四肢，连接皮下电极连续监测标准Ⅱ导联心电图，颈部正中分离气管并切开气管进行插管，用动物呼吸麻醉机进行机械通气，潮气量设为2 mL·100 g-1，通气频率70 min-1。右颈总动脉插入24号套管针连接压力换能器，持续监测平均动脉压(mean arterial blood pressure，MAP)和心率(heart rate，HR)，左侧颈内静脉置管作为药物输液通道，使用加热毯将体温维持在(36.5±1.0)℃。于胸骨左缘打开胸腔并剪开心包膜，暴露心脏，以左冠状静脉主干为标志，以6.0的无损伤缝合线在左心耳下方1～2 mm作线结，针深约1.5 mm，于肺动脉圆锥与左心耳之间出针，将直径为2 mm长度为0.5 cm的聚乙烯管套于线的末端，同时以持针器夹紧缝合线造成缺血和松开缝合线模拟再灌注。将结扎后心电图ST段明显升高、结扎线远端心肌颜色苍白作为心肌缺血的标志，释放后最初苍白区域的充血反应是再灌注成功的标志。

1.3 实验分组72只SD雄性大鼠随机分为6组，每组12只。假手术组：大鼠手术时只挂线不结扎，持续灌注150 min；缺血再灌注组(I/R组)：缺血30 min，再灌注120 min；DMSO组：制备大鼠心脏I/R模型，于再灌注前5 min给予<0.2%的DMSO；舒芬太尼后处理组(Sufen组)：于再灌注前3 min给予1 μg·kg-1舒芬太尼(用生理盐水稀释至1 mL舒芬太尼注射液)；PD组：再灌注前5 min 给予20 μmol·L-1PD98059(1.0 g PD98059溶于150 mL DMSO中)；PD98059+舒芬太尼后处理组(PD+Sufen组)：于再灌注前3和5 min分别给予1 μg·kg-1舒芬太尼和20 μmol·L-1PD98059。

1.4 血流动力学指标检测大鼠右颈总动脉插入24号套管针连接压力换能器，于缺血前即刻(T0)和再灌注30 min(T1)、60 min(T2)、90 min(T3)、2 h(T4)持续监测MAP和HR。

1.5 大鼠心肌梗死面积检测于再灌注2 h后迅速取出大鼠心脏，用心脏分割器分割为5～6块，切成2 mm厚组织。分割后的心脏置于1% 2，3，5氯化三苯基四氮唑(TTC)中振荡染色，避光恒温孵育20 min。PBS缓冲液冲洗后使用10%甲醛固定24 h，观察心肌梗死范围。梗死区为灰白色，非梗死区为砖红色，使用Alpha View 凝胶图像分析系统分析。心肌缺血面积以缺血区心肌质量/左室质量(AAR/LV)表示，心肌梗死面积以梗死区心肌质量/缺血区心肌质量(IS/AAR)表示。

1.6 Western blotting 法检测大鼠心肌组织中p-ERK1/2和p-p70S6K 蛋白表达水平取约300 mg 大鼠左心室，剪碎，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂(PMSF)，低温下超声细胞破碎仪裂解3次。取上清的心肌组织提取液，使用BCA进行蛋白定量，每组取30 μg蛋白上样，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。一抗为p-ERK1、p-ERK2和p-p70S6K。二抗为HRP 标记山羊抗小鼠二抗，用ECL发光法检测目的蛋白表达水平。以GAPDH作为内参校正上样误差，凝胶成像仪拍照。Image J软件进行灰度分析，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

2 结 果

2.1 不同时间各组大鼠MAP和HR与T0时比较，T1～T4时I/R组、Sufen组、DMSO组、PD组和PD+Sufen组大鼠MAP和HR均明显降低(P<0.05)。与假手术组比较，T1～T4时其他各组大鼠MAP和HR均降低(P<0.05)；与I/R组比较，T3时Sufen组大鼠MAP降低(P<0.05)，HR明显升高(P<0.05)，其余时间点各组大鼠MAP和HR差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠心肌梗死面积与I/R组比较，Sufen组大鼠心肌梗死面积明显减少(P<0.05)；与Sufen组比较，PD组和 PD+Sufen组大鼠心肌梗死面积明显增加(P<0.05)；I/R组、DMSO组、PD组和PD+Sufen组大鼠心肌梗死面积组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 不同时间点各组大鼠MAP和HR

表2 各组大鼠心肌梗死面积

2.3 各组大鼠心肌组织中p-ERK1/2和p-p70S6K 蛋白表达水平与假手术组比较，I/R 组、Sufen组和DMSO 组大鼠心肌组织中p-ERK1/2蛋白表达水平及PD组、PD+Sufen组、I/R 组、Sufen组和DMSO 组大鼠心肌组织中p-p70S6K 蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)；与I/R 组比较，Sufen组大鼠心肌组织中p-ERK1/2和p-p70S6K蛋白表达水平均进一步升高(P<0.05)，PD组和PD+Sufen组大鼠心肌组织中p-ERK1/2蛋白表达水平降低(P<0.05)；与Sufen组比较，PD+Sufen组大鼠心肌组织中p-p70S6K和p-ERK1/2蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。见图1和图2。

Lane 1: Sham group; Lane 2: PD group; Lane 3: PD+Sufen group; Lane 4:I/R group; Lane 5: Sufen group; Lane 6:DMSO group.

3 讨 论

心肌缺血再灌注是急性心力衰竭的主要原因。MIRI后不完全修复和纤维组织增生可导致持续性心肌损伤，并逐渐发展为慢性心力衰竭，对人体健康造成严重危害[15]。已有研究[16]表明：舒芬太尼在心肌缺血再灌注中可以特异性地保护心肌功能。舒芬太尼后处理对MIRI的保护作用一直是研究的热点，但其机制复杂，存在很多争议。本实验构建了MIRI大鼠模型，测定大鼠心肌缺血再灌注末的心功能指标和心肌梗死范围，结果显示：Sufen 组大鼠MAP、HR均高于I/R 组，心肌梗死范围低于I/R 组，舒芬太尼后处理能够改善大鼠心功能指标，减少MIRI后的心肌梗死面积，表明舒芬太尼对MIRI后的心肌具有保护作用；与I/R组比较， PD+Sufen组大鼠MAP、HR及心肌梗死面积差异无统计学意义，表明作为ERK抑制剂的PD98059抑制了舒芬太尼后处理的心肌保护作用，也证明了舒芬太尼后处理的保护作用机制与ERK信号通路有关。

1: Sham group; 2: PD group; 3: PD+Sufen group; 4:I/R group; 5: Sufen group; 6:DMSO group.*P<0.05 compared with Sham group; △P<0.05 compared with I/ R group; #P<0.05 compared with Sufen group.

研究[17]显示：舒芬太尼可以通过ERK1/2信号通路途径实现对MIRI的保护作用。在正常心肌细胞中ERK1/2呈低表达，但是当受到I/R刺激时，ERK1/2被激活并表达上调。本研究结果显示：与假手术组比较，I/R组大鼠心肌组织中p-ERK1/2蛋白表达水平明显升高，而Sufen组大鼠心肌组织中p-ERK1/2蛋白表达水平进一步高于I/R组，表明舒芬太尼后处理通过增加p-ERK1/2的表达激活ERK信号通路进而发挥对MIRI后大鼠心肌的保护作用；而PD+Sufen组大鼠心肌组织中p-ERK1/2蛋白表达水平明显低于Sufen组，表明给予PD98059后其心肌保护作用消失，进一步说明舒芬太尼后处理通过激活ERK信号通路发挥对大鼠的心肌保护作用。

吴宥熹等[18]研究证明：荭草苷在大鼠缺血再灌注模型中对心肌的保护作用是通过ERK调节其下游靶点p70S6K的表达实现的。 张静等[19]证实：七氟醚后处理可能通过p70S6K参与了心肌保护作用。CHEN等[20]证实：可以通过激活p70S6K减轻MIRI。p-p70S6K是ERK信号通路的下游靶点，参与合成蛋白质。本研究结果显示：大鼠心肌组织中 p-p70S6K蛋白表达水平随着p-ERK1/2表达水平的升高而升高，且与I/R组比较，Sufen组大鼠心肌组织中p-p70S6K蛋白表达水平明显升高，说明p70S6K的磷酸化依赖于ERK信号通路的激活，同时PD能抑制p70S6K的活性。作为ERK1/2的抑制剂，PD能完全抑制ERK1/2的磷酸化，却不能有效抑制p70S6K的磷酸化，可能还存在其他的信号通路调节p70S6K的磷酸化。

综上所述，舒芬太尼后处理激活ERK1/2信号通路，使ERK1/2磷酸化，进一步促进p70S6K的磷酸化，舒芬太尼后处理通过ERK1/2介导的p70S6K信号通路对MIRI大鼠心肌细胞起保护作用。