基于调控结肠组织中SCF和c-kit mRNA表达分析苍术燥性效应量效关系

谢 颖，周仲实，刘艳菊，2，肖锟钰，雷 林

(1.湖北中医药大学药学院中药炮制教研室，湖北 武汉 430065；2.湖北省中药炮制工程技术研究中心，湖北 武汉 430065)

苍术为菊科植物茅苍术或北苍术的干燥根茎，始载于《神农本草经》[1]。苍术味辛、苦、温，归脾、胃、肝经，具有燥湿健脾、祛风散寒和明目的功效[2]。苍术具有较强的燥性，生品燥性强烈多用于湿证的治疗，炮制后燥性得到缓和，健脾作用增强[3]。古人对苍术的燥性早有认知，并运用多种不同的方法进行炮制，以缓和其燥性[4]，主要用于湿阻中焦等证。目前国内外多采用湿阻中焦证和脾虚泄泻证等模型研究苍术对动物胃肠动力的影响，以探寻其燥湿健脾的物质基础及其机制[5-7]。苍术之燥性是其药性的重要表现，既可发挥药效作用，又能引起不良反应[8]。本课题组前期对苍术的燥性化学部位及其效应进行了相关研究，但关于苍术剂量与燥性表现的量-效关系未进行系统分析。

干细胞因子(stem cell factor，SCF)/SCF受体c-kit信号途径在肠道运动方面发挥重要的作用[9]。研究[10-11]显示：慢传输性便秘的发生发展与SCF和c-kit表达降低有关；祝婧等[12]在研究枳壳燥性时发现：长期使用枳壳生品会抑制结肠SCF和c-kit基因的表达。由此推断，SCF/c-kit信号途径影响便秘的发生，同时与燥性相关。本课题组在前期研究苍术燥性的基础上，除选择常用效应指标外，增加便秘相关基因SCF和c-kit的表达作为考察指标，系统研究不同剂量苍术挥发油对小鼠燥性效应的影响，为临床合理用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试药、主要试剂和仪器SPF级C57BL/6小鼠，雄性，6～7周龄，体质量18～20 g，由湖北实验动物研究中心提供，动物生产许可证号：SCXK(鄂)2017-0012。

取苍术饮片，打粉，称取苍术粗粉500 g置于5 000 mL的圆底烧瓶中，加入4 000 mL蒸馏水，于电热套中恒温加热回流提取，至油量不再增加，弃去前3滴油，石油醚萃取，静置过夜，萃取后至蒸发皿中于通风橱内挥去石油醚，得苍术挥发油，避光密封保存于-20℃冰箱备用。精密称取苍术挥发油于容量瓶中，加入1%吐温-80溶液，定容，混匀。配成12.33 g·L-1的185 mg·kg-1剂量组试药剂量，同法配置成24.66 g·L-1的370 mg·kg-1剂量组试药剂量、36.99 g·L-1的555 mg·kg-1剂量组试药剂量和49.32 g·L-1的740 mg·kg-1剂量组试药剂量。

石油醚、吐温-80、氯仿、异丙醇和无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，TRIzol和焦碳酸二乙酯(DEPC)(美国Amresco公司 )，水通道蛋白2(aquaporin 2,AQP2)抗体(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)，苏木素和伊红(HE)染色液(北京索莱宝科技有限公司)，山羊抗兔IgG二抗[艾博抗(上海)贸易有限公司]。切片机(浙江省永康市兆申电器有限公司)，烘箱和打粉机(广州康恒仪器有限公司)，包埋机(武汉俊杰电子有限公司)，正置荧光显微镜(日本Nikon公司)，荧光定量PCR仪(德国JENA公司)，离心机(韩国Gene公司)。

1.2 实验动物分组和处理75只小鼠随机分为对照组和185、370、555及740 mg·kg-1苍术挥发油组，每组15只，适应性喂养1周后，对照组小鼠给予0.015 mL·g-1的1%吐温-80溶液灌胃，其余各组小鼠按对应剂量给予0.015 mL·g-1苍术挥发油灌胃，每天灌胃给药1次，连续给药 14 d。

1.3 小鼠日均饮水量和日均尿量测定以每组每只小鼠的每周饮水的平均量计算，每日定时添加与测量饮水量，前1 d的水质量M1与当天所剩的水质量M2的差值为该组小鼠的当日饮水总量，除以各组小鼠的只数，即为每只小鼠每日平均饮水量。小鼠给药1周后，使用小鼠代谢笼收集小鼠每日12 h尿液，收集期间禁水，记录每日尿量，连续1周，计算各组小鼠每日平均尿量，除以小鼠个数，即为该组每只小鼠日平均尿量。因收集尿液同时小鼠禁食禁水，为避免小鼠在此过程中死亡，遂将每组老鼠分为5只一小组，每日选取10只，交替收集尿液。

1.4 免疫组织化学法检测小鼠肾组织中AQP2蛋白表达水平小鼠处死后，迅速取出肾脏，解剖刀矢状面切开，将组织置于4%多聚甲醛固定液中固定、包埋、切片，采用免疫组织化学法检测。每张切片随机选3个200倍视野，采用 Image-Pro Plus 6.0 软件分析小鼠肾脏内棕黄色区域的平均光密度(AOD)值，以AOD值代表AQP2蛋白表达水平。

1.5 计算小鼠脾脏系数和肾脏系数称小鼠体质量，处死后剖腹，小心摘取脾脏和肾脏，称质量，计算脏器系数。脏器系数=脏器质量(g)/体质量(g)。

1.6 RT-PCR法检测小鼠结肠组织中SCF和c-kit mRNA表达水平取各组小鼠结肠组织样本于匀浆器中，加入TRIzol试剂提取总RNA，测定其浓度与纯度，根据逆转录试剂盒说明，将RNA逆转录为cDNA，进行PCR扩增。扩增条件：95℃、1 min；95℃、20 s，60℃、45 s，循环40次。从美国国家生物技术信息中心(NCBI)获取目的基因mRNA的全长序列，采用Primer-BLAST软件设计引物序列，由北京擎科生物科技有限公司合成。相关引物序列：SCF，F 5′-GAATCTCCGAAGAGGCCAGAA-3′，R 5′-GCTGCAACAGGGGGTAACAT-3′；c-kit，F 5′-CAGTGTGTGGCAGAGGGATT-3′，R 5′-TGGGCCTGGATTTGCTCTTT-3′。采用2-ΔΔCt法计算结肠组织中SCF和c-kit mRNA表达水平。

2 结 果

2.1 各组小鼠行为学观察灌胃给药2周后，与对照组比较，740 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠饮食量降低，体质量增长缓慢，自发活动减少，出现嗜睡、喜卧、四肢发软、毛发毛糙无光泽和大便干结等表现，其他剂量苍术挥发油组小鼠无明显异常。

2.2 各组小鼠日均饮水量和日均尿量与对照组比较，185、370和555 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠日均饮水量差异无统计学意义(P>0.05)， 740 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠日均饮水量明显增加(P<0.01)。与对照组比较，185和370 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠日均尿量差异无统计学意义(P>0.05)，555 和740 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠日均尿量明显降低(P<0.01)。见表1。

2.3 各组小鼠肾组织中AQP2蛋白表达水平与对照组比较，185、370和555 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠肾组织中AQP2蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，740 mg·kg-1组小鼠肾组织中AQP2蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。见图1(插页三)和表2。

2.4 各组小鼠肾脏系数和脾脏系数与对照组比较，各剂量苍术挥发油组小鼠肾脏系数差异无统计学意义(P>0.05)，185和370 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠脾脏系数差异无统计学意义(P>0.05)，555和740 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠脾脏系数明显降低(P<0.01)。见表3。

表1 各组小鼠日均饮水量和日均尿量

表2 各组小鼠肾组织中AQP2蛋白表达水平

表3 各组小鼠肾脏系数和脾脏系数

2.5 各组小鼠结肠组织中SCF和c-kit mRNA表达水平与对照组比较，185 和370 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠结肠组织中SCF mRNA表达水平明显升高(P<0.05)，555 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠结肠组织中SCF mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，740 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠结肠组织中SCF mRNA表达水平明显降低(P<0.01)；与对照组比较，185 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠结肠组织中c-kit mRNA表达水平明显升高(P<0.05)，370 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠结肠组织中c-kit mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，555 和740 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠结肠组织中c-kit mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组小鼠结肠组织中SCF和c-kit mRNA表达水平

3 讨 论

中药的燥性不仅包括治疗作用，同时也包括不良反应[13]。中医辩证用药，根据病症不同，用药剂量有所不同。《中华人民共和国药典一部》[2]规定苍术剂量为3～9 g，而古代医家用苍术治疗脾胃湿证时，组方所用苍术剂量远超药典剂量。如清代刘完素的《素问病机气宜保命集》中苍术汤所用到的苍术剂量为4两(约149.2 g)，金代李杲的《脾胃论》升阳除湿防风汤中苍术用药剂量同样为4两(约149.2 g)。上述经方主治脾胃湿证，其苍术用量是常规用量的15倍，也高出本实验燥性基础剂量，但安全有效，未表现出明显不良反应。其原因可能是大剂量使用苍术用于治疗脾胃湿证，正是治病之所需，未见燥性表现，可能与中医的“有故无殒，亦无殒也”理论有关。因此在病理情况下，用高剂量苍术仍以发挥药效为主。本研究以健康小鼠为研究对象，考虑健康小鼠在正常生理状态下对药物反应更敏感，便于观察。

基于本课题组前期对苍术燥性效应研究结果，本实验选择小鼠日均饮水量、日均尿量、肾组织中AQP2蛋白表达水平和脏器系数等常用燥性效应指标。水通道蛋白 (aquaporins, AQPs) 是一种与水分子进出细胞膜相关的膜镶嵌蛋白，其中AQP2主要分布在肾集合管上皮细胞，在水分子重吸收, 尿液形成过程中起重要作用[14]。 研究[15]显示：肾组织中AQP2表达水平降低可引起尿液增加，肾组织中AQP2表达水平升高则尿液减少，AQP2对维持机体水平衡、调节体液容量和渗透压十分重要。文献[16]报道：津液不足或外燥侵袭的津液虚证使脏腑组织失去濡养，表现为耳、鼻、咽、喉、皮肤和大便等干燥，眼球深凹，口渴，小便短少，脉细数等津液亏虚症候。本研究结果显示：高剂量苍术挥发油可使小鼠产生口干、口渴、少尿和大便干结等，符合津液亏虚证特点，推测高剂量苍术挥发油可能导致小鼠机体津液的亏损。

c-kit属于酪氨酸激酶受体家族一员，主要调节细胞的增殖和分化[17]。SCF是c-kit的天然配体，SCF在全身多种组织细胞中均有表达，主要是由骨髓中的基质细胞产生，在胃肠道中，平滑肌细胞也能产生SCF[18]。Cajal间质细胞(interstitial cells of cajal, ICC)是胃肠道的起搏细胞，已被普遍认为在胃肠道动力障碍性疾病中具有重要作用[19]。近年来研究[9]显示：ICC的特异受体c-kit及其配体SCF构成的信号途径对ICC的发生、发育及功能维持具有重要的调控作用；便秘的发生与胃肠道ICC分布和功能异常有密切关联，便秘患者或动物的结肠中SCF和C-kit基因表达较正常者降低[10]。SCF/c-kit系统受损后，会使肠道运输能力减弱[11]，而腹泻动物模型中SCF和c-kit基因表达升高[20]。

本研究以健康C57BL/6[2]小鼠为研究对象，以《中华人民共和国药典一部》规定苍术最大用量的2、4、6和8倍所得挥发油梯度(185、370、555和740 mg·kg-1)给药，结果显示：185和370 mg·kg-1苍术挥发油对健康小鼠未表现出燥性作用，555 mg·kg-1以上剂量苍术挥发油组小鼠出现燥性表现，740 mg·kg-1苍术挥发油组小鼠燥性表现明显，提示给予健康小鼠8倍剂量苍术挥发油可产生明显燥性。

综上所述，高剂量的苍术挥发油可能通过影响SCF/c-kit信号通路，从而影响了ICC的发生和发育，导致胃肠道功能紊乱，进而引起小鼠大便的干结或便秘，与苍术临床用药表征相印证。