Micro PET/CT分子显像观察广枣-7味丸抗缺血/再灌注损伤作用机制

张国建，韦丽虹，肖云峰，王文睿，王雪梅，鲁海文

(1.内蒙古医科大学附属医院核医学科, 内蒙古 呼和浩特 010050；2.内蒙古自治区国际蒙医医院药学部，内蒙古 呼和浩特 010065；3.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心，内蒙古 呼和浩特 010110；4.内蒙古医科大学附属医院影像教研室,内蒙古 呼和浩特 010050)

随着心血管病患病人数不断攀升，如何通过有效手段降低心血管病发病率与死亡率已成为重大公共卫生问题[1]。心肌组织缺血后可得到再灌注[2]，可能加重功能障碍及结构损伤[3]，即心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)。药物预适应是保护受损心肌的常用方法之一。广枣-7味丸治疗冠心病、心绞痛，抗心律失常及保护心肌等方面效果已获肯定[4-5]，但对其作用机制尚未完全明了。本研究以Micro PET/CT分子显像观察广枣-7味丸抗MIRI作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级雄性SD大鼠120只(内蒙古医科大学动物实验中心)，体质量(400±50)g，随机均分为6组，每组20只。①低、中、高剂量组：将广枣-7味丸研磨成粉末混悬于CMC-Na，连续灌胃14天,剂量分别为150 mg/(kg·d)、300 mg/(kg·d)、600 mg/(kg·d)，灌胃结束后2 h造模。②空白对照组：0.5%羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose, CMC-Na)连续灌胃14天，剂量为5 ml/(kg·d)。③模型对照组：结扎冠状动脉左前降支60 s，恢复血流再灌注，0.5% CMC-Na连续灌胃14天，5 ml/(kg·d)。④阳性对照组：复方丹参滴丸粉末混悬于CMC-Na，连续灌胃14天，300 mg/(kg·d)，结束后2 h造模。

1.2 MIRI模型制备 腹腔注射10%水合氯醛(10 ml/100 g体质量)麻醉，仰卧位保定，固定四肢，行气管插管，连接小动物呼吸机(潮气量20 ml/kg体质量，呼吸比1∶2，频率40次/分)。胸部备皮，于左锁骨中线与左侧第3～5肋间开胸，充分暴露心脏，以5-0号结扎线活结扎冠状动脉左前降支60 s，以心电图T波改变、心肌颜色由红变为浅红色为心肌缺血造模成功。松解结扎线使血流再通，迅速将心脏送回胸腔,清除胸腔内血液，排除空气并关闭胸腔逐层缝合。去呼吸机，使动物恢复自主呼吸。于造模前后各时段描记心电图。

1.3 Micro PET/CT心肌显像 采用Siemens Innovation Drive MM小动物PET/CT扫描仪，以GE MINItrace回旋加速器合成13N-ammonia显像剂，放射化学纯度>98%。将模型鼠置于恒温麻醉舱中，以2.5%异氟烷混合气体(体积比，异氟烷：氧气)麻醉成功后俯卧位保定于Micro PET/CT检查床，以3.5%异氟烷混合气体持续麻醉。经鼠尾静脉注射13N-ammonia2 mCi后首先采集CT图像，电压80 kV，电流500 μA，扫描层厚0.06 mm；5 min后采集PET图像，采集时间10 min，视野12.7 cm。

1.4 数据处理及图像判读 于Siemens Inveon MM工作站分别获得CT和PET及融合图像，由2名高年资核医学医师盲法独立阅片，利用IRW图像融合软件进行图像判读及计算、分析，意见不一时经讨论决定。心肌缺血部位最大层面及上下2个较小层面勾画ROI，软件自动得出心肌缺损感兴趣容积(volume of interest， VOI)。计算建模后心肌平均标准摄取值(mean standardized uptake value, SUVmean)。

1.5 血清学指标 自颈总动脉取MIRI大鼠血5 ml，加入肝素，1 500 r/min离心10 min后取血清，以全自动生化分析仪测定血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)和肌酸激酶(creatine kinase, CK)。

1.6 病理观察 显像完成后处死模型鼠，取出心脏，用固定液冲洗，将左心室前壁心肌组织切成条状，放在固定液中2 h，再用0.09 mmol KH2PO4漂洗15 min并保存。常规乙醇逐级脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋，间断均匀切片，HE染色，于光镜下观察心肌病理结构改变。

1.7 统计学分析 采用SPSS 22.0统计分析软件。以±s表示满足正态分布和方差齐性的计量资料，中位数(上下四分位数)表示不满足正态分布或方差齐性的计量资料。组间及组内采用方差分析，配对设计资料采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MIRI模型建立 对100只大鼠行冠状动脉左前降支前下1/3阻断60 s，9只死于建模过程中，4只死于麻醉意外，5只死于显像过程中，见表1。建模后心电图Ⅱ导联T波改变ST段压低>0.2 mV提示建模成功，其组织病理学改变见图1、2。

图1 心肌大体解剖 A.正常心肌； B.MIRI模型大鼠心尖局部心肌组织颜色变浅(红圈) 图2 心肌组织病理学(HE，×400) A.正常心肌； B.MIRI模型大鼠心肌

表1 各组各时间点心肌缺血体积比较(cm3，±s)

表1 各组各时间点心肌缺血体积比较(cm3，±s)

组别24 h48 h72 hF值P值低剂量组(n=15)6.33±2.023.31±1.331.26±0.6846.520.001中剂量组(n=17)6.01±1.562.61±1.01-110.71<0.001高剂量组(n=17)3.32±0.861.32±0.58-116.72<0.001空白对照组(n=19)-----模型对照组(n=18)7.13±2.427.02±1.846.98±2.180.0410.960阳性对照组(n=16)4.12±0.692.38±0.90-150.33<0.001F值15.7553.19187.66--P值<0.001<0.001<0.001-- 注:24 h高剂量组与阳性对照组差异无统计学意义(P>0.05),余组间差异有统计学意义(P均<0.05);48 h模型对照组与其他组间差异均有统计学意义(P均<0.05),高剂量组与阳性对照组间差异无统计学意义(P>0.05),高剂量组与中、低剂量组差异有统计学意义(P均<0.05);72 h模型对照组与其他组间差异均有统计学意义(P均<0.05)

2.2 心肌缺血体积及SUVmean变化 各组各时间点心肌缺血体积见表1、图3。各剂量组受损心肌体积均减小，以高剂量组效果最好；各剂量组各时间点心肌缺血部位SUVmean见表2，缺血部位SUVmean随时间延长逐渐增高，提示血流逐渐恢复。

图3 各组各时间点心肌血流灌注图像(垂直长轴) 左心室心尖部显像剂稀疏区面积(箭)在模型对照组随时间无明显变化，低剂量组随时间推移逐渐减小，中剂量组随时间推移逐渐减小至消失，高剂量组随时间推移逐渐减小至消失

表2 各时间点心肌缺血部位SUVmean(±s)

表2 各时间点心肌缺血部位SUVmean(±s)

组别24 h48 h72 hF值P值低剂量组(n=15)0.77±0.16*#1.22±0.52*#3.62±0.76*#121.82*#<0.001中剂量组(n=17)0.94±0.15*#2.11±0.50*#4.75±0.33*#450.82*#<0.001高剂量组(n=17)0.97±0.16*#2.45±0.44*#4.94±0.44*#435.75*#<0.001空白对照组(n=19)4.98±0.485.05±0.475.04±0.420.0950.910模型对照组(n=18)0.61±0.210.71±0.180.75±0.172.4080.102阳性对照组(n=16)0.95±0.14*#2.40±0.40*#4.81±0.35*#556.83*#<0.001F值560.22171.09205.17--P值<0.001<0.001<0.001--

注：*：与空白对照组比较P<0.05；#：与模型对照组比较P<0.05

2.3 血清学指标 各组血清氧化应激指标SOD、MDA水平和心肌酶LDH、CK活性见表3。

表3 各组大鼠血清学指标(±s)

表3 各组大鼠血清学指标(±s)

组别LDH(U/L)CK(U/L)SOD(U/ml)MDA(nmol/g)低剂量组(n=15)691.73±162.27*#1 153.74±187.81*#462.82±37.14*#7.98±1.26*#中剂量组(n=17)649.92±171.25*#1 165.42±167.83*#491.38±24.19*#7.24±1.08**#高剂量组(n=17)671.38±168.69*#1 209.84±163.47*#511.83±23.86*#7.69±1.34*#空白对照组(n=19)609.54±142.411 091.45±195.141523.51±27.656.91±1.42模型对照组(n=18)721.51±138.531 259.37±207.17452.45±30.178.17±1.93阳性对照组(n=16)636.28±151.62*#1 157.42±148.43*#490.87±27.72*#7.38±1.26*#F值59.1774.8441.489.67P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：*：与空白对照组比较P<0.05；#：与模型对照组比较P<0.05

3 讨论

目前研究蒙药疗效及药效机制大多针对某种成分采用生物血清学测量分析、血清药理学技术、制剂学或是离体心肌组织病理学方法[6-8]，但蒙药所获功效是各成分协同作用、联合起效，以多靶点、多渠道、多层次完成整体调节而产生治病生物效应的结果，重在调节机体功能、调和体素，恢复机体自愈能力，将各成分分割开来不利于理解其机制。本研究以分子影像学方法观察蒙药对于活体的作用，结果表明利用分子影像学方法可无创评价蒙药活体作用机制。

MIRI可引起心脏功能障碍、生化代谢异常、心肌梗死面积扩大及心肌组织病理改变等，可能是继发心力衰竭和心源性死亡的潜在重要原因之一。氧自由基主要包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和羟自由基(·OH)，几乎可与细胞内所有有机物反应而破坏核酸、蛋白质、氨基酸和脂类化合物，损害细胞功能[4]。正常生理条件下细胞内存在抗氧化物质，可及时清除氧自由基，使其生成与降解处于动态平衡；心肌缺血/再灌注恢复血液及氧供应时,氧自由基大量产生、急剧堆积及抗氧化酶类活性下降引发链式脂质过氧化反应,损伤细胞膜、细胞器乃至细胞核酸,引发细胞内钙超载、造成心肌细胞急性或慢性损伤，导致细胞坏死凋亡。

蒙药广枣-7味丸由广枣、沉香、肉豆蔻、木香、丁香、枫香脂和牛心粉七味药材组成，可养心、益气、安神，用于胸闷疼痛、心悸气短、心神不安及失眠健忘[9]，多糖、黄酮类和酚类是其主要抗氧化活性成分[10-12]，能明显降低小鼠耗氧量及耗氧速度，提高耐缺氧能力、扩张冠状动脉、改善微循环、清除自由基，并提高心肌SOD活性[13]。

13N-ammonia PET显像可早期评估受损心肌血流灌注状态。朱君艳等[14]研究证实13N-ammonia PET可用于早期发现放射性心脏损伤，并监测心脏损伤动态发展。本研究表明13N-ammonia PET心肌灌注显像能够评价广枣-7味丸活体抗MIRI作用，各剂量组对MIRI均具有保护作用，以中、高剂量组效果好，并均能保护受损心肌，以高剂量组效果最好。

LDH和CK水平被认为是心肌损伤的标志酶。SOD为自由基清除剂，广泛存在于生物体各种组织中，能清除超氧阴离子自由基。MDA含量是过氧化反应的指标，可间接揭示活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成水平。本研究证实，各剂量广枣-7味丸均可清除体内自由基而保护缺血-再灌注损伤心肌，高剂量组对SOD作用效果最好，中剂量组对于MDA、LDH作用效果最好，而低剂量组对CK作用效果最好。

氧化应激是导致细胞凋亡的重要原因之一[15]。HARMAN[16]提出自由基理论，认为衰老由2种机制导致，一是过氧化物作用致使细胞发生氧化应激反应，二是线粒体呼吸作用而致衰老。随着年龄增长，机体内MDA含量逐渐升高，SOD含量逐渐降低[17-18],氧化应激通过调控凋亡基因相关通路诱导细胞凋亡[19-20]。

综上，广枣-7味丸通过清除体内自由基、减轻氧化应激损伤、影响相关酶活性等方式发挥抗MIRI作用。Micro PET/CT分子显像能无创动态检测活体MIRI，准确评估广枣-7味丸对鼠MIRI的保护作用；各剂量广枣-7味丸均对MIRI具有保护作用，高剂量效果更好。