RNAi下调CCT8抑制非小细胞肺癌A549细胞转移潜能

2020-08-05朱迎伟褚旭邱家勇孙瑜霞毛毅敏

分子诊断与治疗杂志 2020年7期

朱迎伟褚旭邱家勇孙瑜霞毛毅敏

肺癌大多数起源于支气管黏膜上皮，是最为常见的肺组织原发恶性肿瘤，肺癌中有80%的患者属于非小细胞肺癌，研究非小细胞肺癌发生机制对于靶向基因治疗肺癌具有重要意义［1］。含有TCP1伴侣蛋白亚基8（Chaperonin containing TCP1，subunit 8，CCT8）是一种在生命体内存在的分子伴侣，参与DNA复制、多肽折叠、细胞信号转导、蛋白降解等过程，CCT8属于Ⅱ型伴侣素，参与肿瘤进展［2］。研究报道显示，CCT8在肿瘤中表达上调，并且其表达改变与肿瘤患者的预后、转移等有关［3］。在胶质瘤中的研究表明，CCT8在胶质瘤中高表达与胶质瘤分级有关，沉默CCT8可以有效抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭［4］。以前的研究报道显示，CCT8在非小细胞肺癌组织中高表达，并且其表达水平同肺癌患者淋巴结转移、预后、组织学分级等有关［5］。目前对于CCT8对非小细胞肺癌细胞侵袭、迁移和上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用还不明确。本次实验以非小细胞肺癌A549细胞作为体外实验对象，探讨下调CCT8对细胞增殖和恶性转移潜能的影响，以期为寻找有效的靶基因治疗肺癌提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料

非小细胞肺癌A549细胞购自上海信裕生物科技有限公司；Lipofectamine 2000、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen；蛋白提取试剂盒、二辛可宁酸（BCA）试剂盒、十二烷基硫酸钠，钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳（dodecyl sulfate，sodium salt-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒、四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Vimentin抗体和p-Akt抗体购自美国santacruze；CCT8抗体购自美国Proteintech；E-cadherin抗体、MMP-9抗体购自北京义翘神州科技有限公司；siRNA control、CCT8 siRNA由南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成。

1.2 细胞转染

A549细胞分成3组，分别为Control、si-NC、si-CCT8组，si-NC、si-CCT8组分别为转染siRNA control、CCT8 siRNA的A549细胞，Control为不做转染的对照A549细胞。A549细胞转染方法按照转染试剂Lipofectamine 2000进行，步骤完全按照操作说明书标准流程操作。

1.3 Realtime PCR方法检测CCT8 siRNA对CCT8 mRNA表达影响

收集转染48 h以后的Control、si-NC、si-CCT8组细胞，用RNA提取试剂盒提取总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，按照试剂盒说明书操作进行PCR反应。按照2-ΔΔCT法分析CCT8水平。

1.4 Western blot方法检测CCT8 siRNA对CCT8蛋白表达影响

收集转染48 h以后的Control、si-NC、si-CCT8组细胞，按蛋白提取试剂盒提取总蛋白，以BCA方法定量。具体方法参考文献［2］，CCT8蛋白水平=CCT8条带灰度值÷内参GAPDH灰度值

1.5 MTT检测检测CCT8 siRNA对细胞增殖影响

取Control、si-NC、si-CCT8组培养48 h的细胞。按照MTT试剂盒说明书进行检测细胞增殖。

1.6 Transwell小室检测CCT8 siRNA对细胞侵袭和迁移影响

用不含血清的培养液悬浮Control、si-NC、si-CCT8组细胞，按照参考文献［2］方法检测细胞侵袭和迁移数量。

1.7 Western blot检测CCT8 siRNA对MMP-9、Vimentin、E-cadherin和p-Akt蛋白表达影响

收集转染48 h以后的Control、si-NC、si-CCT8组细胞，按照1.4中方法检测蛋白表达变化，内参为GAPDH。

1.8 Akt信号激活剂对下调CCT8影响细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的影响

取转染CCT8 siRNA后的A549细胞，以含有100 ng/mL的Akt激活剂IGF-1的细胞培养液培养，记为si-CCT8+IGF-1，以si-CCT8作为对照，分别按照1.4、1.5、1.6中的方法分别检测MMP-9、Vimentin、E-cadherin和p-Akt蛋白表达，细胞迁移和侵袭，细胞增殖。

1.9 统计分析

采用SPSS 21.0软件统计分析，计量资料用（）表示，两组数据用独立样本t检验，多组比较用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCT8siRNA下调A549细胞中CCT8表达水平

与si-NC组相比，转染CCT8 siRNA后A549细胞中CCT8mRNA和蛋白水平均下降差异有统计学意义（P＜0.05），见图1和表1。

2.2 下调CCT8对A549细胞增殖、侵袭、迁移影响

与si-NC组相比，转染CCT8 siRNA后A549细胞中细胞A值、侵袭数目和迁移数目均下降（P＜0.05），见表2。

图1 Western blot检测CCT8 siRNA转染后A549细胞中CCT8蛋白水平Figure 1 Western blot analysis expressions of CCT8 protein in A549 cells transfected with CCT8 siRNA

表1 CCT8 siRNA转染后A549细胞中CCT8 mRNA和蛋白水平（±s）Table 1 Expressions of CCT8 mRNA and protein in A549 cells transfected with CCT8 siRNA（±s）

组别对照组si-NC si-CCT8 F值P值CCT8 mRNA 1.00±0.09 1.01±0.12 0.40±0.04 45.573 0.000 CCT8蛋白0.48±0.06 0.49±0.07 0.21±0.02 25.517 0.001

表2 CCT8 siRNA转染后A549细胞A值、侵袭数目和迁移数目（±s）Table 2 A value，number of invasion and number of migration in A549 cells transfected with CCT8 siRNA（±s）

组别对照组si-NC si-CCT8 F值P值A值0.51±0.06 0.50±0.04 0.21±0.03 42.836 0.000侵袭数目95.54±10.20 97.36±9.87 60.17±2.05 19.237 0.003迁移数目138.64±12.02 140.08±11.49 86.95±7.53 24.745 0.000

图2 Western blot检测CCT8 siRNA转染后A549细胞中MMP-9和Vimentin、E-cadherin蛋白水平Figure 2 Western blot analysis expressions of MMP-9,Vimentin and E-cadherin protein in A549 cells transfected with CCT8 siRNA

2.3 下调CCT8对A549细胞MMP-9蛋白和EMT相关蛋白表达影响

与si-NC组相比，转染CCT8 siRNA后A549细胞中MMP-9蛋白水平降低上皮标志蛋白E-cadherin水平升高，间质标志蛋白Vimentin P-kAT水平下降（P＜0.05），表3和见图2。

表3 CCT8 siRNA转染后A549细胞中MMP-9和Vimentin、E-cadherin、p-Akt水平（±s）Table 3 Expressions of MMP-9，Vimentin and E-cadherin、p-Akt in A549 cells transfected with CCT8 siRNA（±s）

注：与si-NC比较，a P＜0.05。

组别对照组si-NC si-CCT8 F值P值MMP-9 0.47±0.05 0.48±0.03 0.28±0.04 22.860 0.002 Vimentin 0.53±0.06 0.52±0.04 0.30±0.04 22.368 0.002 E-cadherin 0.31±0.05 0.32±0.03 0.46±0.05 10.729 0.010 p-Akt/Akt 0.31±0.04 0.33±0.06 0.16±0.02 13.875 0.000

2.4 下调CCT8对A549细胞中Akt信号通路影响

与si-NC组相比，转染CCT8 siRNA后A549细胞中p-Akt蛋白水平降低（P＜0.05），见图3。

图3 Western blot检测CCT8 siRNA转染后A549细胞中p-Akt蛋白水平Figure 3 Western blot analysis expressions of p-Akt protein in A549 cells transfected with CCT8 siRNA

2.5 Akt信号激活剂对下调CCT8抑制A549细胞增殖、侵袭、迁移和EMT的逆转作用

Akt信号激活剂IGF-1处理CCT8 siRNA转染后的A549细胞，与si-CCT8组相比，si-CCT8+IGF-1组细胞MMP-9、Vimentin蛋白水平升高，E-cadherin蛋白水平降低，细胞A值、侵袭数目和迁移数目升高（P＜0.05），见图4和表4。

图4 Western blot检测Akt信号激活剂和CCT8 siRNA转染后A549细胞中p-Akt、E-cadherin、MMP-9、Vimentin蛋白水平Figure 4 Western blot analysis expressions of p-Akt，E-cadherin，MMP-9，Vimentin protein in A549 cells after Akt signaling activator and CCT8 siRNA transfection

表4 Akt信号激活剂和CCT8 siRNA转染后A549细胞A值、侵袭数目、迁移数目和p-Akt、E-cadherin、MMP-9、Vimentin蛋白水平（±s）Table 4 A value，invasion number，migration number and p-Akt，E-cadherin，MMP-9，Vimentin protein levels of A549 cells after Akt signaling activator and CCT8 siRNA transfection（±s）

组别si-CCT8 si-CCT8+IGF-1 t值P值p-Akt/Akt 0.17±0.03 0.41±0.05 7.129 0.002 MMP-9 0.29±0.03 0.52±0.06 5.939 0.004 Vimentin 0.28±0.04 0.44±0.05 4.328 0.012 E-cadherin 0.50±0.06 0.31±0.04 4.564 0.010 A值0.22±0.04 0.45±0.05 6.222 0.003侵袭数目62.81±3.69 85.14±6.34 5.272 0.006迁移数目87.98±9.62 127.42±11.73 4.503 0.011

3 讨论

CCT8参与肿瘤进程，研究显示，CCT8在肝细胞癌中高表达，与预后不良有关，siRNA沉默CCT8抑制细胞增殖并阻断细胞进入S期［6］。在肝癌中发现下调CCT8可以降低肝癌细胞迁移和侵袭能力［7］。还有研究发现CCT8在淋巴结转移的食管鳞状细胞癌患者肿瘤组织中高表达，与患者预后不良和顺铂耐药性相关；敲低CCT8通过调节α-肌动蛋白和β-微管蛋白抑制食管鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭，促进细胞凋亡［8］。本实验表明，下调CCT8可以在体外抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，这与在肝癌、食管鳞状细胞癌中下调CCT8抑制癌细胞迁移和侵袭的作用相同。还有研究发现CCT8上调与成年大鼠创伤性脑损伤后神经细胞凋亡有关［9］。但本实验未研究CCT8对非小细胞肺癌细胞凋亡的影响。以上结果表明说明CCT8在癌症中可能作为一个肿瘤促进因子在起作用。本实验结果显示下调CCT8具有抑制非小细胞肺癌细胞恶性表型的作用，靶向抑制CCT8可能是有效抵抗非小细胞肺癌进展的途径。

基质金属蛋白酶9（Matrix metallo proteinase-9，MMP-9）是基质金属蛋白酶家族的成员，细胞外基质降解的关键酶［10］。而细胞外基质降解是肿瘤细胞转移的基础和前提条件［11］。有研究报道MMP-9在非小细胞肺癌中高表达，与肿瘤分期及淋巴结转移关系密切，且与癌细胞侵袭转移呈正相关［12］。还有研显示，非小细胞肺癌组织中E-钙黏蛋白（E-cadherin）低表达、波形蛋白（Vimentin）高表达，在肿瘤的侵袭和转移过程中起重要调控作用［13］；E-cadherin和Vimentin是EMT水平改变的标志，EMT水平越高标志着肿瘤转移能力越强，有研究报道通过调节EMT可促进肺癌细胞侵袭和迁移能力［14］。本次实验结果表明，下调CCT8可以抑制MMP-9的表达，促进E-cadherin表达，并下调Vimentin表达水平。

综上，CCT8可能是非小细胞肺癌治疗的有效靶标，靶向抑制CCT8表达可以降低非小细胞肺癌细胞恶性增殖、迁移、侵袭和EMT，且CCT8作用机制与Akt信号有关。本实验结果为研究CCT8在肺癌中的作用机制提供了参考。在以后实验中会探讨CCT8具体的靶向结合位点和调控网络。