下调lncRNA HCG18靶向调控miR-34a影响口腔鳞癌SCC4细胞增殖、侵袭以及迁移的分子机制

2020-08-05丁延晶王立新邱静怡余日月

分子诊断与治疗杂志 2020年7期

丁延晶王立新邱静怡余日月

长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度大于200 nt的非编码RNA，其最初被人们认为没有生物学作用，后续研究发现，lncRNA参与调控基因印记、mRNA剪切、表观遗传学等过程，并且通过对基因多方面调控影响细胞的生长、转移［1］。研究表明，lncRNA与肿瘤的进展有关，其异常表达往往与肿瘤转移程度等具有密切关系［2］。lncRNA人类白细胞抗原复合体18（human leucocyte antigen complex group 18，HCG18）与多种疾病的病理进程有关［3］。HCG18在非小细胞肺癌等肿瘤中高表达，HCG18表达上调与肿瘤患者的预后和转移有关，下调HCG18可以抑制肿瘤的细胞恶性增殖和转移［4］。miR-34a是近些年来备受关注的miR-34家族成员，其在肝癌、口腔癌等肿瘤中表达下调，上调其表达可以抑制肿瘤细胞恶性表型［5］。通过细胞转染的方法下调细胞中HCG18表达，探讨下调HCG18对口腔鳞癌细胞增殖和迁移的影响和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

口腔鳞癌CAL27、HB96细胞购自上海慧颖生物科技有限公司；miR-34a inhibitor、inhibitor control、HCG18 shRNA、HCG18 shRNA、miR-34a mimics、mimics control均由上海吉玛制药技术有限公司构建合成；口腔鳞癌SCC4、HB96细胞购自上海美轩生物科技有限公司；N-cadherin抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology：正常口腔黏膜（Normal Oral Keratinocyte，NOK）细胞购自上海艾研生物科技有限公司；E-cadherin抗体购自美国Proteintech Group；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 HCG18在口腔鳞癌细胞中的表达检测

采用Realtime PCR方法测定，步骤如下：收集口腔鳞癌CAL27、SCC4、HB96细胞和正常口腔黏膜NOK细胞，提取细胞总RNA，提取方法按照Trizol操作说明进行。逆转录反应体系为：1μL的RT Enzyme Mix I、1μL的Random 6 mers、4μL的5×Prime Script Buffer、1μL的Oligo dT Primer，最后添加RNase-free H2O至20μL。收集cDNA，用SYBR进行PCR反应，PCR反应程序为：预变性（95℃30 s），变性（95℃5 s），退火延伸（60℃60 s），一共40个循环。结果按照2-△△Ct法计算。

1.3 细胞转染及下调效果测定

按照Lipofectamine 2000转染试剂进行细胞转染。把转染HCG18 shRNA和shRNA control的细胞设置为sh-HCG18和sh-NC组，把没有转染的细胞设置为Control组。细胞转染后48 h，用Realtime PCR方法测定HCG18表达，步骤同1.2。

1.4 下调HCG18对口腔鳞癌细胞增殖影响检测

采用噻唑蓝（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）方法测定。

1.5 下调HCG18对口腔鳞癌细胞迁移和侵袭影响检测

采用Transwell小室测定，侵袭实验前用基质胶包被，迁移实验前省略包被步骤，其余步骤相同，简述如下：以不含血清的细胞培养液将Control、sh-NC、sh-HCG18组细胞悬浮，然后吸取200 μL的细胞种植到小室的上室中，同时在下室中加入500μL的含血清细胞培养液，放在37℃的CO2培养箱中培养24 h。甲醇固定，结晶紫染色。放在显微镜下随机选取5个视野计数细胞穿膜数目，结果取平均值即为细胞侵袭或迁移数目。

1.6 下调HCG18对口腔鳞癌细胞中N-cadherin、E-cadherin蛋白表达影响检测

采用Western blot方法测定，步骤简述如下：提取Control、sh-NC、sh-HCG18组细胞总蛋白，每个孔内蛋白上样量均为40μg；电泳电压为90 V恒压电泳0.5 h，然后以120 V恒压电泳2 h。将NC膜裁剪成与分离胶大小相同，在60 V恒压条件下转膜，转膜装置在4℃条件下进行，转膜时间设置为60 min。5%脱脂奶粉的封闭；一抗结合过夜；二抗孵育2 h。以电化学发光（Electro-Chemi-Luminescence，ECL）方法显色。结果用mage J分析条带的OD值，把GAPDH作为内参。

1.7 HCG18靶基因预测以及鉴定

生物信息学软件（starbase）预测HCG18的靶基因，发现miR-34a与HCG18有互补结合位点。用荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。分别将野生型（WT）和突变型（MUT）HCG18荧光素酶报告载体与miR-34a mimics和mimics control共转染到口腔鳞癌细胞中，48 h后，检测其荧光素酶活性变化。WT和MUT荧光素酶报告载体均由湖南丰晖生物科技有限公司构建。收集Control、sh-NC、sh-HCG18组细胞，U6为内参，以Realtime PCR方法测定miR-34a表达变化，步骤同1.2。

1.8 miR-34a inhibitor对下调HCG18的口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭影响检测

在口腔鳞癌细胞中分别共转染miR-34a inhibitor、HCG18 shRNA和inhibitor control、HCG18 shRNA，设置为sh-HCG18+Anti-miR-34a、sh-HCG18+Anti-NC组，按照1.4、1.5、1.6中方法测定细胞增殖、迁移、侵袭以及N-cadherin、E-cadherin蛋白表达变化。

1.9 统计学分析

采用SPSS 21.0软件统计分析，计量资料用（）表示，两组间比较用独立样本t检验，多组比较采用方差分析，组间比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 口腔鳞癌细胞和正常口腔细胞中HCG18表达差异

HCG18在口腔鳞癌CAL27、SCC4、HB96细胞中的表达水平均高于正常口腔黏膜NOK细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 HCG18在口腔鳞癌细胞和正常口腔黏膜细胞中HCG18表达差异比较（±s）Table 1 Comparison of HCG18 expression in oral squamous cell carcinoma cells and normal oral mucosa cells（±s）

细胞NOK CAL27 HB96 SCC4 F值P值HCG18水平1.00±0.09 1.69±0.12 2.41±0.23 2.94±0.21 215.60＜0.001

图1 Western blot测定N-cadherin、E-cadherin蛋白表达Figure 1 western blot analysis of the expression of N-cadherin and E-cadherin

2.2 HCG18 shRNA对口腔鳞癌SCC4细胞增殖、侵袭和迁移影响

转染HCG18 shRNA后的口腔鳞癌SCC4细胞中HCG18表达水平降低，细胞增殖能力下降，细胞迁移以及侵袭数目均下降，细胞中N-cadherin蛋白表达水平下降，E-cadherin蛋白表达水平升高。见图1和表2。

2.3 HCG18靶向调控miR-34a

生物信息学软件预测miR-34a和HCG18结合位点，WT和miR-34a mimics共转染后的口腔鳞癌SCC4细胞荧光素酶活性下降。见图2和表3。HCG18靶向调控miR-34a。

表2 细胞中HCG18表达、OD值、迁移数目、侵袭数目以及N-cadherin、E-cadherin蛋白表达差异比较（±s）Table 2 Comparison of HCG18 expression,OD value,migration number,invasion number,N-cadherin and E-cadherin protein expression in cells（±s）

注：与sh-NC比，*P＜0.05。

组别Control sh-NC sh-HCG18 F值P值HCG18水平1.00±0.10 0.99±0.09 0.33±0.03*209.50＜0.001 OD值0.46±0.05 0.45±0.07 0.35±0.04*11.11＜0.001迁移数目128.64±10.24 129.47±11.86 92.28±6.52*42.27＜0.001侵袭数目102.48±9.63 101.82±10.39 80.66±7.29*16.39＜0.001 N-cadherin 0.60±0.06 0.59±0.05 0.31±0.04*95.03＜0.001 E-cadherin 0.27±0.04 0.29±0.03 0.39±0.05*22.32＜0.001

图2 miR-34a和HCG18结合位点示意图Figure 2 Schematic diagram of predicted binding sites of miR-34a and HCG18

表3 细胞荧光素酶活性（±s）Table 3 luciferase activity of cells（±s）

组别Mimics control miR-34a mimics t值P值MUT 1.00±0.11 1.02±0.13 0.35 0.73 WT 1.00±0.08 0.67±0.05 10.49＜0.001

2.4 下调HCG18对口腔鳞癌SCC4细胞miR-34a表达影响

转染HCG18 shRNA后的口腔鳞癌SCC4细胞中miR-34a表达水平升高。见表4。

表4 HCG18 shRNA转染前后口腔鳞癌SCC4细胞中miR-34a表达差异比较（±s）Table 4 Comparison of miR-34a expression in oral squamous cell carcinoma SCC4 cells before and after HCG18 shRNA transfection（±s）

注：与sh-NC比，a P＜0.05。

组别Control sh-NC sh-HCG18 F值P值miR-34a水平1.00±0.12 0.97±0.08 1.85±0.16a 145.10＜0.001

2.5 miR-34a inhibitor对下调HCG18的口腔鳞癌SCC4细胞增殖、侵袭和迁移影响

与共转染inhibitor control和HCG18 shRNA的细胞比较，共转染miR-34a inhibitor和HCG18 shRNA后的口腔鳞癌SCC4细胞中miR-34a表达下调，细胞OD值、迁移数目、侵袭数目均升高，细胞中N-cadherin蛋白表达水平升高，E-cadherin蛋白表达水平下降。见图3和表5。

图3 Western blot检测N-cadherin、E-cadherin蛋白表达Figure 3 Western blot analysis of the expression of N-cadherin and E-cadherin

3 讨论

人类基因组中有约2%左右可以转录编码蛋白质，而基因组转录形成的大多数RNA没有编码功能，成为非编码RNA［6］。随着研究的不断深入，人们逐渐发现非编码RNA在细胞生长和发育过程发挥各种不同的生物学作用［7］。lncRNA作为一种常见的非编码RNA，其可以通过调控基因转录而发挥生物学作用［8］。HCG18在肿瘤中发挥类似癌基因的作用，目前已经在肺癌、肝癌等肿瘤中证实，下调HCG18可以抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力［4，9］。本次实验结果提示HCG18在口腔鳞癌中可能发挥促进作用，这与上述研究结果一致，均说明HCG18可能是肿瘤促进因子。

恶性肿瘤向远端转移是肿瘤死亡率高的重要原因，肿瘤细胞从原来的位置脱落以后，通过黏附作用进入新的组织和器官［10］。EMT是指上皮细胞特征逐渐消失而表现出间质细胞特性［11］。研究显示，肿瘤细胞EMT后转移概率更大［12］。N-cadherin是间质细胞标志蛋白，其属于黏附分子，参与细胞同细胞之间的动态黏附过程［13］。N-cadherin在肿瘤中发挥癌基因的作用，高表达N-cadherin可以促进肿瘤的转移和浸润［14］。E-cadherin是上皮细胞标志蛋白，其不仅可以保持细胞与细胞之间的完整连接，还可以抑制细胞侵袭和迁移能力，E-cadherin具有抗肿瘤进展的作用［15］。本次实验结果表明，下调HCG18后的口腔鳞癌细胞中N-cadherin表达水平降低，E-cadherin表达水平升高，提示下调HCG18抑制口腔鳞癌细胞EMT，进一步证实了下调HCG18具有抗口腔鳞癌转移的作用。

表5 细胞中miR-34a表达、OD值、迁移数目、侵袭数目以及N-cadherin、E-cadherin蛋白表达差异比较（±s）Table 5 Comparison of miR-34a expression，OD value，migration number，invasion number，N-cadherin and E-cadherin protein expression（±s）

组别sh-HCG18+Anti-NC sh-HCG18+Anti-miR-34a t值P值miR-34a水平1.00±0.08 0.42±0.04 19.45＜0.001 OD值0.34±0.05 0.46±0.03 6.17＜0.001迁移数目91.32±7.59 120.48±10.67 6.68＜0.001侵袭数目82.96±5.81 99.47±9.63 4.40＜0.001 N-cadherin 0.32±0.05 0.63±0.07 10.81＜0.001 E-cadherin 0.38±0.06 0.24±0.04 5.82＜0.001

研究报道显示，lncRNA作用机制较为复杂，其可以通过调控基因的转录而发挥多种生物学作用，并且同一个lncRNA可以同时调控多个靶基因［16］。本次实验显示，HCG18可以靶向负调控口腔鳞癌细胞中miR-34a的表达，HCG18作用机制可能与miR-34a有关。miR-34a基因定位在1p36.23染色体上，其功能缺失多见于白血病、乳腺癌等恶性肿瘤，miR-34a通过靶向调控下游基因的表达影响细胞的侵袭、迁移［17］。之前的研究表明，miR-34a可以降低口腔鳞癌细胞的侵袭和迁移能力。

综上，下调HCG18在口腔鳞癌细胞增殖、侵袭、迁移和EMT中发挥抑制作用，其作用机制与靶向上调miR-34a的表达有关，目前对于miR-34a作用的下游机制还不明确。我们的实验结果为靶向基因治疗口腔鳞癌提供了参考，为研究HCG18在口腔鳞癌中的调控网络提供了资料。