贵阳花溪久安茶树炭疽病病原菌(Colletotrichun gloeosporioides)的分离鉴定及生物学特性

雷娇娇 田力 袁伟

摘要：为明确贵阳花溪久安茶树炭疽病的病原菌，利用组织分离法和柯赫氏法则对病原菌进行分离与验证，利用形态学与rDNA-ITS对致病菌进行鉴定，同时对致病菌的生物学特性进行系统研究。结果表明，引起久安茶树炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌（Colletotrichun gloeosporioides）;生物学特性测定结果表明，C. gloeosporioides适宜生长条件：在温度为28 ℃的条件下，以OA培养基和SNA培养基作为培养基，半光照，pH值为5～7，以乳糖作碳源，以牛肉膏作氮源。通过本研究明确了花溪久安茶炭疽病病原，可以为该地区茶树炭疽病病害流行及防控提供理论依据。

关键词：茶树;炭疽病;病原菌分离;生物学特性;胶孢炭疽菌

中图分类号：S435.711  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）11-0100-06

收稿日期：2019-05-29

基金項目：现代生态农业创新性示范基地建设（编号：091821104022292027-4）;贵州大学“SRT计划”项目[编号：贵大SRT字（2018）293号];贵州省大学生创新创业训练计划[编号：贵大（省）创字2019（155）]。

作者简介：雷娇娇（1995—），女，贵州织金人，主要从事林木病理学相关研究。E-mail：980435499@qq.com。

通信作者：于 存，博士，讲师，主要从事森林病理学相关研究。E-mail：chifengyucun@163.com。  近年来，贵州省大力发展茶产业，至2019年茶树种植面积约已达50万hm2[1]。而且随着2019年两会代表孙志刚在审议政府工作报告中提到“要喝没有污染的茶到贵州来”，可见茶叶产业在贵州经济发展及扶贫攻坚中起到了重要的作用。在贵州省的茶树集中连片栽植过程中，有大量病虫害发生，对茶产业造成严重的威胁。贵州省茶树主要病虫害包括茶饼病、茶白星病、茶圆赤星病、茶轮纹叶枯病、茶轮斑病、茶煤病、茶炭疽病等[2-3]。其中，茶叶炭疽病是茶树重要的叶部病害之一，该病害的发生可引起茶叶部坏死、影响茶的光合作用、严重者导致其死亡。以往的报道中有关茶树炭疽病病原菌的种类主要包括山茶刺孢菌（Colletotrichun camelliae）、雕刻刺盘孢菌（C.carveri）、马尤斯刺盘孢菌（C.majus）、壳皮炭疽菌（C.crassipes）、胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、果生刺盘孢菌（C.fructicola）、暹罗刺盘孢菌（C.siamense）、尖孢炭疽菌（C.acutatum）、河南刺盘孢菌（C.henanense）、江西刺盘孢菌（C.jiangxiense）等[4]。不同病原菌在引起植物发病的过程中受温度、湿度、pH值、碳源、氮源等环境因素的影响，明确病原菌的生物学特性，可为防治该病害采取有效措施奠定基础[5]。

贵州省贵阳市花溪区久安乡位于黔中腹地，久安乡土壤呈酸性，有机成分含量高，非常适合茶树生长，是适宜生产优质有机生态茶叶的地方[6]。2013年，久安乡生态精品茶示范园区被列入“5个100工程”，截至2015年，建成面积为666.67 hm2的规模化、标准化、设施完善的特色精品茶园。近年来，随着茶园面积的不断扩大，加之茶园被列入欧盟有机认证和雨林认证，不允许使用化学农药防治病虫害的发生，进而导致久安乡茶园内病虫害频发。近年来，久安乡茶场茶树炭疽病发生较严重，而茶树炭疽病致病菌种类仍未明确，因此，开展该地区茶树炭疽病致病菌鉴定及病原致病性研究对于当地茶园茶树炭疽病病害防治具有重要意义。本研究将从形态学以及分子生物学对茶树炭疽病病原菌进行分离与鉴定，对其生物学特性作出探索，为进一步了解久安乡茶场的炭疽病病害防控提供重要的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

燕麦琼脂（OA）培养基：30 g燕麦，20 g琼脂，1 L 蒸馏水;合成低营养琼脂（SNA）培养基：1 g KH2PO4，2 g KNO3，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，20 g琼脂，0.2 g葡萄糖，0.2 g蔗糖，1 L蒸馏水;马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，20 g琼脂，1 L蒸馏水;马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基：200 g马铃薯，20 g蔗糖，20 g琼脂，1 L 蒸馏水;茶汁培养基：20 g葡萄糖，3 g CaCO3，50 g 茶叶，20 g琼脂，1 L蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 茶树炭疽病病原菌的分离与验证 于贵阳市花溪区久安乡茶园采集患有炭疽病的5张典型叶片。利用组织分离法对5张病叶进行病原菌的分离。将分离菌株离体回接至刺伤和未刺伤的茶树叶片上，用脱脂棉进行保湿在28 ℃条件下培养，以相同处理接种PDA菌饼的叶片作为对照。以上试验均重复5次。

1.2.2 茶树炭疽病病原菌的鉴定 利用形态学与核糖体DNA基因内转录间隔区（rDNA-ITS）测序结合的方法对“1.2.1节”中可以引起茶树炭疽病的病原菌进行鉴定。利用形态学方法[7]，主要对病原菌菌落特征、颜色、菌丝及孢子大小等进行观察;rDNA-ITS鉴定参考李婕等的方法[8-9]，首先利用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，简称CTAB）法提取致病菌总DNA，利用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行序列扩增，得到序列后，通过NCBI的Blast进行序列的比对分析，同时利用MEGA 7.0进行包含致病菌ITS序列在内的系统进化树，综合形态学与分子生物学的方法进行病原菌的鉴定。

1.2.3 茶树炭疽病病原菌生物学特性测定 分别将茶树炭疽病病原菌菌株接种至不同培养基（OA培养基、SNA培养基、PDA培养基、PSA培养基、茶汁培养基），并设置不同碳源（麦芽糖、蔗糖、淀粉、果糖、乳糖）、不同氮源（尿素、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钠、牛肉膏、蛋白胨）、不同温度（15、20、25、28、30、35 ℃）、不同光照（全光照、半光照、全黑暗）、不同pH值（4、5、6、7、8、9）。以上处理分别在培养3、4、5、6、7、8、9、10 d后测定菌落生长半径，分析不同因素对茶炭疽病病原菌生长的影响。以上处理均重复3次。

2 结果与分析

2.1 茶树炭疽病的分离及回接验证

茶树炭疽病野外发病症状如图1-a。茶树炭疽病发生初期，在叶片上形成灰色病斑，病斑处凹陷，后期易破碎，病健交界处明显。病斑上的小黑点即为分生孢子盘，寄生于叶片表皮下，后期分生孢子穿破表皮，随风雨飞散，作为病原物再次侵染茶树[8]。利用组织分离法从5个不同发病茶叶中分离纯化得到5株菌株，分别命名为TJ2-1、TJ2-2、TJ2-3、TJ2-4、TJ2-5。将5株菌株分别接种至刺伤和未刺伤茶树叶片上，结果表明，在刺伤叶片上菌株TJ2-1可以引起茶树炭疽病相同症状（图1-b）。而在未刺伤叶片上5株菌株都未引起茶叶发病。对发病离体叶片采取组织分离法分离病原菌，同样得到了与TJ2-1相同的菌株。由此可以确定菌株TJ2-1为茶树炭疽病的病原菌。菌株 TJ2-1 主要通过伤口侵入到茶树叶片内引起发病。

2.2 茶树炭疽病病原菌鉴定

病原菌在温度为28 ℃，PDA培养基暗培养条件下，菌落生长速度为0.9 cm/d，菌落白色至浅灰色，气生菌丝较长，毯状，边缘较整齐，背面一般会形成黑色物质（图2-a），培养后期于菌落中心产生橙黄色分生孢子堆。菌丝有隔（图2-b），分生孢子椭圆形（图2-c），两端钝圆，浅灰色，表面粗糙，中间凹陷，大小为（7.3～20.0 μm）×（2.0～5.0 μm）。分生孢子上易产生分生孢子附着孢，附着孢呈不规则形、球形，表面黑色或灰黑色，表面灰

色颗粒状物明显，大小为（6.1～10.2 μm）×（4.5～6.8 μm）。参照魏景超的《真菌鉴定手册》以及邵力平等的《真菌分类学》等书籍，鉴定茶树炭疽病病原菌属于胶孢炭疽菌（Colletotrichun gloeosporioides）[10-11]。

扩增菌株TJ2-1的rDNA-ITS获得长度为541 bp的分子序列，GenBank登录号为MK757870。NCBI的Blast比对结果显示，该序列与GenBank登录号为KF836743.1的C. gloeosporioides的序列覆盖度为100%，序列相似性为100%。由图3可知，菌株TJ2-1的ITS序列与胶孢炭疽菌聚为一类，亲缘关系较近，而与C. theobromicola菌株间遗传距离较远，具有相对远的亲缘关系。由此结合形态学与分子生物学鉴定茶树炭疽病致病菌为胶孢炭疽菌。

2.3 茶树炭疽病病原菌生物学特性观察

2.3.1 光照对胶孢炭疽菌生长的影响 由图4可知，在不同光照条件下，菌株均可生长，在相同培养时间内，不同光照处理对菌丝生长影响差异不明显。不同时间光照对胶孢炭疽菌生长的影响结果显示，在培养初期3～8 d时全黑暗条件下更有利于菌落生长。而培养至9 d开始，半光照更利于胶孢炭疽菌的生长。不同光照及时间内， 全光照对菌落

生长均较全黑暗和半光照生长缓慢。由此可见，茶树常年處在高山多雾，日照少的自然条件下，是炭疽病严重发生的原因之一。

2.3.2 不同pH值对胶孢炭疽菌菌丝生长的影响 由图5可知，在pH值为4～9时，菌丝均可生长，在培养3～5 d时，pH值=7时更利于菌丝生长，而在培养 6～10 d时适宜菌丝生长的pH值范围为 5～6。结合茶树的生长条件可知，在中性偏酸性的条件下更有利于胶孢炭疽菌的生长。

2.3.3 不同氮源对胶孢炭疽菌生长的影响 由图6可知，以尿素作为氮源时，菌落在不同时间均没有生长。以牛肉膏作为氮源时，更利于菌丝的生长，以硝酸钠、硫酸铵、硝酸铵、蛋白胨作为氮源对菌落生长的促进效果依次减弱。

2.3.4 不同碳源对胶孢炭疽菌生长的影响 由图7可知，在培养3～4 d时，不同碳源条件下菌丝长势基本一致。5 d以后，以乳糖和果糖作为碳源更利于菌丝的生长。综合评价不同碳源对胶孢炭疽菌生长影响的排序为乳糖>果糖>麦芽糖>蔗糖>淀粉。

2.3.5 不同培养基对菌丝生长的影响 由图8可知，在培养初期OA培养基、SNA培养基更利于菌落

的生长，在培养后期不同培养基对菌落生长的影响差异不明显。综合分析，不同培养基对胶孢炭疽菌生长影响的排序为OA培养基>SNA培养基>PSA培养基>PDA培养基>茶汁培养基。

2.3.6 不同温度对菌丝生长的影响 由图9可知，在温度为15～30 ℃范围内，胶孢炭疽菌均可生长，而当温度高于35 ℃时菌落的停止生长。在不同温度范围内，28 ℃更利于胶孢炭疽菌的生长，温度由28 ℃逐渐降低或升高，胶孢炭疽菌的生长均呈下降趋势。因此，夏季是炭疽病流行的高发时期，应注意病害的预防监测。

3 讨论与结论

贵州茶区普遍存在高海拔、多云雾、寡日照、气候冷凉等特点，茶轮斑病、炭疽病等病害的发生与虫害相比更为严重[12]。而对病害的有效防治须要准确掌握引起病害的病原菌[13]。以往研究中报道的茶树炭疽病病原菌主要为炭疽菌属，本研究明确贵阳花溪久安茶炭疽病病原为胶孢炭疽菌。对病原菌生物学特性的了解可以有助于从病原角度了解病害发生发展及指导防治措施的制定[14-15]。胶孢炭疽菌生物学特性结果表明， 不同温度对胶孢炭

疽生长的影响差异明显，其中当温度为28 ℃时更利于菌株的生长，当温度下降或上升均不利于菌株的生长，由此推断该病害更容易发生在 28 ℃ 左右的夏季，这与实际调查发现的该地区茶树炭疽病多发生在夏季（夏季平均温度为23～30 ℃）的结果相符。病原菌在引起病害过程中要经历接触、侵入、潜育、发病等4个发病历程，其中潜育期时间长短决定了该病害发生周期的长短，也决定了一种病害再侵染周期的长短。而在病原菌潜育期过程中主要以吸收营养，增加自身的生长为主。因此，了解病原菌所需要的营养条件，可以判断其在不同条件下病原菌生长的速度及潜育期的长短，进而合理地制定防治措施。在本研究中，胶孢炭疽菌以SNA培养基、OA培养基作为培养基，以乳糖作为碳源，以牛肉膏作为氮源，pH值为5～7时更利于其生长，而不同光照处理对胶孢炭疽菌的影响差异不明显，以初期黑暗条件，后期半光照条件更利于菌株的生长，因此，可以将茶树尽量种植在光照充足的地域以减缓茶树炭疽病的发生。通过本研究明确了贵阳花溪久安茶树炭疽病的病原及其生物学特性，为该地区今后茶树炭疽病的有效防治奠定了基础，可以为今后该病原菌的进一步研究提供理论依据。

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