miR-322对大鼠高原性肺动脉高压的作用及机制研究

张凤涛，李晓红，王景景，孙洪涛，陈翀，陈锋

由于高原低压、低氧环境的影响，长期居住或急进高原人群常常会有不同程度的高原肺动脉高压（high altitude pulmonary hypertension，HAPH）。高原肺水肿与HAPH 联系密切，高原肺水肿是HAPH、肺泡液累积等因素综合作用的结果。研究认为，HAPH是导致高原肺水肿发病的关键因素，是目前常见的一种治疗不及时可致高病死率的呼吸系统疾病，因此深入了解和探究高原病发病机制，对高原病的防治具有重要意义［1］。HAPH 与心血管舒张有密切联系。研究发现，apelin可通过舒张血管来降低肺动脉高压上升程度以缓解HAPH［2］。HAPH 在低压低氧条件下可诱导缺氧诱导因子-1α等因子上调［3］，其中miR-322表达上调明显，说明其在HAPH形成中有重要的作用［4］。miRNA 是一类高度保守的非编码RNA，可以抑制mRNA的翻译功能或使其降解［5］。本实验拟使用SD大鼠建立缺氧性肺动脉高压模型，通过腺相关病毒转染封闭miR-322相关序列实现差异性表达，以期阐述miR-322对apelin的影响及调控肺动脉高压的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 SPF级雄性SD大鼠40只，8周龄，体质量180～200 g，购自军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK-（军）2012-0004。大鼠饲养于清洁、通风良好环境，自由摄食、饮水。总RNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒（中国福际公司），逆转录试剂盒（K1622）和apelin 抗体（abcam 公司），α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（boster公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗、Alexa 488标记山羊抗小鼠IgG二抗（servicebio公司），Quantscript RTKit和Real Master Mix（Probe）购自天根生化科技有限公司。空载腺病毒以及miR-322-5P封闭腺病毒由和元生物技术（上海）股份有限公司合成。TaqMan探针及引物委托中美泰和公司完成。

1.2 方法

1.2.1 HAPH动物模型建立 40只大鼠以随机数字表法分为常氧组、低氧组、空载体组及miR-322沉默组（n=10），剔除实验过程中死亡大鼠后常氧组10 只，低氧组、空载体组、miR-322沉默组各9只。病毒转染采用气道转染法［6］，转染完成后与低氧组相同方法造模。低压氧舱模拟6 000 m海拔高度，舱内大气压47.5 kPa，9.5%～10.1%O2连续低氧培养21 d，制备低氧性肺动脉高压大鼠模型［7］，常规饲料喂养；常氧组自由呼吸进食，其他条件相同。

1.2.2 大鼠处理与取材 大鼠饲养21 d后，造模大鼠从低压氧舱中快速取出，与常氧组大鼠均采用异氟烷吸入法麻醉，右心漂浮导管法检测肺动脉压，计算各组大鼠平均肺动脉压（mPAP）并取颈动脉血0.5 mL 进行肺动脉氧分压［p（O2）］检测；放血处死各组大鼠，随机数字表法抽取每组大鼠5 只，取肺组织约100 mg 提取总蛋白用于Western blot 检测，20 mg 提取总RNA，30 mg提取miRNA用于PCR检测。

1.2.3 HE染色观察肺组织形态 肺组织置于10%福尔马林中固定，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、HE染色后在光镜下（×200）观察肺组织学形态，每张切片随机读取3个视野。

1.2.4 免疫荧光染色观察α-SMA 表达 石蜡切片经二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，抗原修复，山羊血清封闭，加入α-SMA 一抗，4 ℃过夜，磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）避光洗涤后孵育二抗，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下（×400）观察。

1.2.5 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测肺组织miR-322以及apelinmRNA 表达 严格按照试剂使用说明书提取总RNA 及miRNA，用TaqMAN 探针法进行qPCR 扩增，每个样本做3 个复孔。以10 倍稀释模板样本进行PCR 反应，反应条件：50 ℃预变性2 min，95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共40个循环，以内参照基因（GAPDH）进行相对定量，采用2-ΔΔCt法对结果进行分析，计算miR-322和apelinmRNA表达水平。qPCR引物见表1。

Tab.1 Primer sequence of qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6 Western blot 法检测肺组织apelin 蛋白表达 取约100 mg 肺组织，加入RIPA 裂解液1 mL，冰上研磨制备成匀浆。4 ℃离心10 min，留取上清液并用BCA 法进行蛋白定量。每组取45 μg，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（80 V，100 min）分离后进行转膜、封闭，经封闭后加入apelin一抗（1∶500）4 ℃过夜，次日PBST（含1%吐温-20的磷酸盐缓冲液，PBS-Tween-20）漂洗3 次，每次10 min；加入二抗（1∶5 000），室温摇床1 h后，PBST漂洗3次，每次10 min，加入ECL化学发光剂曝光显影。以目的蛋白与内参GAPDH的灰度值比值代表目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0 统计软件包进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠p（O2）与mPAP 比较 与常氧组比较，低氧组、空载体组及miR-322 沉默组p（O2）均下降，mPAP 均升高；与低氧组比较，miR-322 沉默组p（O2）上升，mPAP 下降（P＜0.05），低氧组和空载体组2指标差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of oxygen partial pressure and mean pulmonary artery pressure between four groups表2 各组大鼠肺动脉氧分压和平均肺动脉压比较（mmHg，）

Tab.2 Comparison of oxygen partial pressure and mean pulmonary artery pressure between four groups表2 各组大鼠肺动脉氧分压和平均肺动脉压比较（mmHg，）

＊P＜0.05；a与常氧组比较，b与低氧组比较，c与空载体组比较，P＜0.05；表3同；1 mmHg=0.133 kPa

mPAP 14.59±1.42 24.96±1.11a 24.95±1.60a 21.61±1.66abc 107.690＊组别常氧组低氧组空载体组miR-322沉默组F n 10 9 9 9 p(O2)98.94±1.90 72.68±4.29a 74.11±4.07a 81.72±4.07abc 104.197＊

2.2 各组肺组织形态学变化 常氧组肺泡间隔正常，组织结构良好。与常氧组比较，低氧组肺泡间隔明显增宽，肺泡及肺间隔可见红细胞，肺泡腔中出现大量炎症细胞，损伤严重，空载组与低氧组损伤程度相似。miR-322 沉默组较低氧组损伤程度降低，见图1。

Fig.1 Comparison of HE staining results between four groups(HE staining,×200)图1 各组大鼠肺动脉形态学变化（HE染色，×200）

2.3 大鼠肺组织α-SMA表达 常氧组肺组织中α-SMA 表达量较低，低氧组较常氧组表达上升，miR-322沉默组较低氧组表达量进一步上升，见图2。

Fig.2 Expressions of α-SMA in lung tissue of four groups(IF，×400)图2 各组大鼠肺组织α-SMA表达情况（免疫荧光，×400）

2.4 各组肺组织miR-322和apelin蛋白及mRNA的表达水平比较 与常氧组比较，低氧组、空载体组及miR-322 沉默组miR-322mRNA 相对表达量、apelin mRNA 和apelin 蛋白相对表达量升高；与低氧组比较，miR-322 沉默组miR-322mRNA 相对表达量降低，apelin mRNA和蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；低氧组与空载体组各指标差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3、图3。

Tab.3 Comparison of expressions of miR-322,apelin protein and mRNA pairs between four groups表3 各组miR-322以及apelin蛋白和mRNA相对表达水（n=5）

Tab.3 Comparison of expressions of miR-322,apelin protein and mRNA pairs between four groups表3 各组miR-322以及apelin蛋白和mRNA相对表达水（n=5）

组别常氧组低氧组空载体组miR-322沉默组F miR-322 mRNA相对表达量1.07±0.14 3.22±0.32a 3.23±0.24a 1.31±0.23bc 120.204＊apelin相对表达量mRNA 1.03±0.19 2.90±0.32a 3.19±0.38a 5.31±0.48abc 120.017＊蛋白0.90±0.16 1.13±0.11a 1.10±0.09a 1.42±0.13abc 14.764＊

Fig.3 Expressions of apelin protein in lung tissues of each group图3 各组肺组织中apelin蛋白表达情况

3 讨论

急进高原地区的人群由于高原低压和低氧环境的影响，常引起急性高原病。急性高原病以低氧性肺动脉高压引起的急性高原肺水肿最为典型，该病起病急、病情重，救治不及时可造成病死率明显增高。急性高原肺水肿发病机制复杂，体内调控基因及影响因子多，发病机制尚不明确［8-9］。目前，关于高原型肺动脉高压研究发现，apelin可在低氧或缺氧条件下扩张心血管以减轻肺动脉压上升程度［10-11］，但大多是在蛋白水平上的研究和探讨，近几年关注于基因水平上探究肺动脉高压的调控机制。miRNA不同基因在不同程度上参与了肺动脉高压的调节［12］。不同的肺动脉高压模型引起的miRNA 表达效果有差异，多种miRNA 如miR-145/143、miR-23b等［13-14］均可影响肺动脉高压的调节，导致肺动脉重塑。但是在高原肺动脉高压发病过程中apelin的调控机制仍不清楚。

本实验中21 d的低压低氧干预使大鼠形成了典型的肺动脉高压，与以往实验研究中的大鼠肺动脉高压的结果一致［7］。本研究结果显示，与常氧组比较，低氧组mPAP、α-SMA、apelin 蛋白以及miR-322mRNA 相对表达量均升高，p（O2）下降，肺组织破坏严重，可见大量炎症细胞浸润。与低氧组相比，miR-322 沉默组mPAP 以及miR-322mRNA 相对表达量均下降，α-SMA、p（O2）、apelin 蛋白相对表达量上升，miR-322 沉默组肺组织损伤程度减轻，表明miR-322mRNA可通过抑制apelin的表达，从而使肺动脉压上升，在miR-322被抑制后，apelin表达上升，降低了肺动脉压上升程度，同时减轻了肺组织的损伤，提示在高原型肺动脉高压中，miR-322 低表达可以上调apelin蛋白的表达，这与Zhu等［10-11］研究结果一致。HE染色结果显示，低氧组肺组织损伤严重，而miR-322沉默组中肺组织损伤明显减轻；免疫荧光结果表明，apelin 高表达可以促进α-SMA 表达，增加血管扩张程度，缓解肺动脉压的上升并且降低血管增厚程度，这与HE结果一致，再次证实miR-322抑制了apelin的表达，内源性apelin 可以舒张血管，增加平滑肌活跃性，这一点不同于吴媛媛等［15］外源性apelin 作用效果结论，该研究认为在临床上要尽可能避免使用外源性apelin 治疗高原肺动脉高压。

综上，大鼠高原型肺动脉高压模型大鼠肺组织中miR-322 和apelin 表达明显升高，在抑制miR-322 后，apelin表达进一步升高，miR-322可能通过降低肺组织内源性apelin 蛋白的表达，降低了机体的血管扩张反应，不利于机体适应高原性气候的生活。