基于线粒体DNA Cyt b西伯利亚狍种群分子系统地理学研究

梁 雪 周绍春 刘艳华*

(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；2.黑龙江省野生动物研究所，哈尔滨，150081)

鹿科(Cervidae)动物广泛分布于整个欧亚大陆，包括40种鹿[1]。狍(Capreolus)是鹿科中分布最广泛的哺乳动物之一，其中包括体形较小的欧洲狍(Capreoluscapreolus)和体形较大的西伯利亚狍(Capreoluspygargus)。这两种狍的区别主要表现在形态和基因上的差异。西伯利亚狍分布范围从伏尔加河右岸延伸到俄罗斯远东地区，包括哈萨克斯坦、天山、阿拉泰、蒙古、中国的华北和华中地区。尽管对亚种的分类仍有争议，但学者普遍认为西伯利亚狍至少由3个亚种组成，即C.pygarguspygargus(从伏尔加河到贝加尔湖和俄罗斯东北部)、C.pygargustianschanicus(或C.c.bedfordi)(天山、蒙古、俄罗斯远东和韩国)和C.pygargusmelanotis(西藏东部、甘肃、四川、中国)。

与欧洲狍相比西伯利亚狍在分子系统地理学上的研究较少。Randi等[2]的研究认为，西伯利亚狍可分为两大集群，即俄罗斯远东阿穆尔地区的东部集群和西伯利亚西部库尔干地区的西部集群。基于RAPD标记(random amlified polymorhic DNA)，Petrosyan等[3]的研究结果证实了将西部和东部群体分别划分为C.pygarguspygargus和C.pygargustianschanicus的科学性。另一方面，根据与其他亚种的形态差异，Xiao等[4]的研究认为在中国东北发现的西伯利亚狍属于C.pygargusmanchuricus亚种。Lorenzini等[5]的系统发育分析研究结果表明西伯利亚狍的3个单倍群分布在该物种整个分布范围内，即俄罗斯西部和东部、吉尔吉斯斯坦、中国东北和华北，但没有明显的地理结构。此外，部分学者[6-7]的研究还发现韩国济州岛的狍与其他种群存在遗传差异，并将韩国济州岛分布的孤立种群命名为第四亚种C.pygargusochracea。

系统地理学以系统发育及地理分布结构为基础开展研究，且将以线粒体基因为基础的系统发育等方法应用于各个生物类群研究。线粒体DNA是一种共价闭合环状的双链DNA分子，具有遵循母系遗传、进化速率快、遗传上相对独立、无组织特异性等优点，在物种系统发育，种内遗传分化等方面具有广泛的应用价值[8-9]。最常用的线粒体DNA标记基因是Cytb基因，因为Cytb是线粒体基因中结构和功能最为清楚的基因之一[10]，该基因进化速度适中，对种群间、种间、属间甚至科间的系统发育研究均适用[11]。因此本研究以Cytb基因为标记方式，对西伯利亚狍分子系统地理学进行探索性研究以期为西伯利亚狍的分子系统地理学研究补充数据。

1 材料和方法

1.1 样品采集和DNA扩增

本研究样品采自小兴安岭地区，通过足迹跟踪收集新鲜狍粪便40份。样品采集时，将每份样品进行封装，封装后的样品低温保存，直至运到实验室放进-20 ℃以下冰箱内。

使用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取粪便DNA，采用引物L14724[12]：5′ CGA GAT CTGAAAAAC CAT CGT TG 3′ 和H15149[13]：5′ AAA CTG CAG CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTC A 3′扩增Cytb序列。PCR反应体系为：2 μLDNA、6 μL dNTPs、0.9 μLF引物、0.9 μLR引物、0.6 μLTaqTMDNA聚合酶、15 μL 1 × PCR buffer、4.6 μL H2O。PCR反应体系在94 ℃预变性2 min，然后进入如下循环：98 ℃ 变性10 s，59 ℃退火30 s，68℃延伸30 s，共35个循环，最后68 ℃延伸10 min，4℃保存。PCR 产物采用 1.0%的常规琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为 5 μL PCR 产物加1 μL 6×loading buffer，120V 电压电泳 30 min，Good wall 染色，凝胶成像系统观察电泳谱带，并将电泳条带较亮较窄的扩增产物送至哈尔滨擎科生物科技有限公司进行纯化并测序。

1.2 数据分析

将所测的序列结果应用Clustal X 2.0软件进行DNA序列排列，并辅以人工校对[14]。通过BLAST搜索[15]，与已知的西伯利亚狍线粒体同源序列比对，确定是否为目的序列。应用DnaSP 4.0软件[16]确定单倍型。应用MEGA 7软件[17]，采用最大似然法、邻接法和最大简约法进行构建系统发育树，通过自引导检验(bootstrap)获得系统分支的置信度(重复次数为1 000)。应用PopART 1.7软件[18]，基于TCS Network分析单倍型之间的系统发育关系。

2 结果

从获得的40份粪便样品中成功扩增出32个序列，序列长度为403 bp，获得9个单倍型，单倍型多样性(h)为(0.813±0.045)，核苷酸多样性(Pi)为(0.004 74±0.000 71)，平均核苷酸变异数(K)为1.911。从GenBank上下载40条序列(表1)，获得23个单倍型。以马鹿(Cervuselaphus)(登录号：GU457434)为外群构建系统发育树。3种不同的系统发育树具有基本相同的拓扑结构，最清晰全面的拓扑结构是由邻接法生成的(图1)。

图1 基于NJ法构建的西伯利亚狍mtDNA Cyt b基因的系统发育树，以马鹿为同源序列的外群，节点处的数字为Bootstrap重复百分比，重复次数为1 000Fig.1 Phylogenetic tree of mtDNA Cyt b gene of Capreolus pygargus constructed based on NJ method.Red deer(Cervus elaphus)was the outgroup of homologous sequence.The number at the node is the percentage of bootstrap repeats with 1 000 repetitions

表1 GenBank下载序列信息Tab.1 GenBank download sequence information

系统发育树主要由4个单倍群组成，分别命名为A、B、C、D。其中A由俄罗斯远东地区(Khabarovsk、Yakutia)和韩国济州岛的单倍型组成。B由哈萨克斯坦、俄罗斯西伯利亚地区(Sverdlovsk、Irkutsk)和波兰等地区的单倍型组成。C由中国东北地区的单倍型组成。D由蒙古地区的单倍型组成。A和B与C、D是并行的姐妹枝。A、B、C基本符合西伯利亚狍亚种分类：C.pygarguspygargus、C.pygargustianschanicus(或C.c.bedfordi)和C.pygargusmelanotis。由西伯利亚狍的单倍型网络分析图(图2)可以看出，西伯利亚狍明显由四簇单倍群组成，其结果与系统发育树一致。

图2 基于TCS Network构建的西伯利亚狍mtDNA Cyt b基因单倍型网络分析Fig.2 Haplotype Network analysis of mtDNA Cyt b gene of Capreolus pygargus constructed based on TCS Network

3 讨论

本研究分析了中国小兴安岭地区40份野生西伯利亚狍样品的线粒体DNA Cytb基因的部分序列，并与GenBank 中其他地区西伯利亚狍的序列进行分析研究，系统发育分析与单倍型网络分析结果表明西伯利亚狍由4个单倍群组成，有较清晰的系统发育关系和地理模式，这与其他学者研究结果相吻合。部分学者[2，19-20]使用mtDNA序列的研究结果表明西伯利亚狍可以分为两个具有地理模式的主要集群，即西伯利亚东部集群和西伯利亚西部集群，且符合西伯利亚狍亚种C.pygarguspygargus和C.pygargustianschanicus的分布范围。另外，Lee[21]使用微卫星标记的研究结果表明，基于Nei’s DA距离建立的UPGMA树具有3簇拓扑结构，结果表明，韩国大陆、蒙古、西伯利亚东部的种群聚为一枝，西伯利亚中部的种群聚为一枝，韩国济州岛的种群单独聚为一枝。

相反，在部分学者的系统地理学研究中认为西伯利亚狍没有明显的地理模式[5，22-23]。Lorenzini等[5]通过贝叶斯分析获得的系统发育树包括3个主要单倍群：单倍群A由俄罗斯西部、吉尔吉斯斯坦、波兰、立陶宛和中国华北等地区的单倍型组成；单倍群B由俄罗斯东部和中国东北地区的单倍型组成；单倍群C由俄罗斯东部、中国东北和华北地区的单倍型组成，遗传谱系和地理分布之间无法建立任何关系。实际上，在西伯利亚、吉尔吉斯坦和俄罗斯远东人口稀少的地区，没有任何自然或人为的屏障来阻止不同种群的西伯利亚狍的混合。Vorobieva等[23]的研究表明，在西伯利亚狍亚种的假定分布范围内，没有发现任何与亚种分布范围一致的单倍群。

在系统发育和单倍型网络分析中发现单倍群B包含假定于欧洲狍分布范围内的单倍型，即波兰地区的单倍型。目前，在伏尔加河和唐河之间的区域被认为是欧洲狍和西伯利亚狍的杂交区域。这两个物种的大部分进化史可能都生活在不同区域中。在史前时期，由于它们重叠区域的交替收缩和扩张，两个物种种群的混合肯定不止一次[24]。因此可能是由于种群扩张过程中高度分化谱系之间的杂交而引起的一个古老基因的渗入[5]。此外，韩国济州岛和俄罗斯远东地区的单倍型组成单倍群A，但在其他学者的研究中，韩国济州岛的西伯利亚狍为一个孤立种群，与其他所有的西伯利亚狍(包括韩国大陆的种群)在基因上存在分歧[21]。有学者对韩国济州岛的西伯利亚狍提出了第四亚种命名C.p.ochracea[7]。由于本研究仅采用mtDNA一种遗传标记方式，具有其母系遗传的局限性，对于韩国济州岛的西伯利亚狍还需基于更多的遗传标记方式开展进一步的研究。

本研究表明，至少有4个不同的遗传谱系可能存在于西伯利亚狍的种群：俄罗斯远东地区和韩国济州岛，俄罗斯西伯利亚地区、哈萨克斯坦和波兰，中国，蒙古。诸如西伯利亚狍之类的食草动物在生态系统中起着重要作用，为大型食肉动物提供了猎物。因此对西伯利亚狍种群进行适当的遗传管理，开展遗传状况持续监测研究，这对于维持生态系统健康发展至关重要。