KPC-rg1抗H1N1流感病毒活性研究初探

李 滢 董艳萍 任 超 黄 茜 李 宁 杨兆祥 张建文

(昆药集团股份有限公司药物研究院,云南 昆明 650100)

0 引 言

病毒是人和动物的重要病原体.据统计,病毒所导致的疾病占所有感染性疾病的75.0%以上,抗病毒治疗在临床上显得尤为重要[1],目前接种疫苗仍然是防止病毒性疾病扩散的最有效方法.

传统病毒疫苗灭活制备工艺中常用的灭活剂有甲醛和β-丙内酯,但制作这类灭活剂疫苗不仅耗时、工艺复杂,而且灭活过程中难以保证病毒抗原的完整性.因此,在保证灭活绝对安全的前提下,缩短灭活时间,降低有效抗原的损失和简化纯化工艺步骤一直是疫苗制作追求的目标,探索新型病毒灭活制剂与佐剂技术成为当今国际研发抗病毒疫苗领域新的热点之一.

使用不同性质的材料进行病毒灭活和相关防毒设备的研发已有大量报道,如高硫酸化K5大肠杆菌多糖衍生物[2]、硫酸乙酰肝素[3]和各种材料制备的纳米制剂[4]等,这些物质主要通过与病毒表面的黏附蛋白配基(viral attachment ligands,VALs)发生强烈的结合而阻止病毒感染细胞.在自然界也存在一些天然物质(如肝素)能模拟细胞膜对应受体的构像(mimicking heparan sulfate proteoglycans,MHSP),与病毒外壳的VALs形成稳定结合从而屏蔽病毒进入细胞.科研人员也努力尝试将MHSP连接到不同的纳米载体上以获得与各种病毒结合力更强且病毒灭活效果更高的广谱抗病毒灭活剂[5].

尽管传统的中医药中没有特效杀灭病毒的单味药或复方,但不可否认的是中医药已对某些病毒性疾病的治疗,如获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)、病毒性感冒、荨麻疹和乙型病毒性肝炎,显示出了一定的优势[6].已有报道中药植物多酚类物质具有强大的抗病毒活性[7],而多糖类拥有抗病毒的活性早已为人所知[8].

肉桂及其所含的成分具有多方面的药理作用,包括降血糖[9-10]、抗氧化[11]、抗肿瘤[12]、抗炎[13]和神经保护[14]等作用.近期有研究报道肉桂用于预防和治疗病毒感染,周明等[15]的研究显示肉桂中的桂皮醛具有抗病毒活性,美国福克斯健康新闻报道Milton Schiffenbauer博士团队在家养肉桂植物中发现抗病毒活性成分[16],以色列特拉维夫大学在中国专利局公开了1项与肉桂提取物抗病毒相关的专利[17].本研究组也使用不同的病毒细胞感染模型对肉桂抗病毒有效组分进行了系统分析,已证明肉桂水提物KPC-rg1在细胞水平可以对包括单纯疱疹(HSV-1)病毒[18]和人类免疫缺陷(human immunodeficiency virus,HIV)病毒在内的多种包膜病毒产生有效的攻击.

为了进一步研究肉桂提取物KPC-rg1对H1N1流感病毒的抗病毒活性,本研究使用小鼠适应型H1N1流感病毒进行动物攻毒感染实验,研究KPC-rg1对在抗H1N1流感病毒的抗病毒活性,以为其进一步研发成为新型病毒灭活材料提供理论支撑.

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

小鼠适应型H1N1流感病毒(A/Puerto Rico/8/1934)由中国医学科学院医学生物学研究所呼吸道病毒研究室提供;Vero E6细胞株购自美国模式菌种收集中心(ATCCCRL-1586);肉桂购自滇芝堂中药材经营部,经鉴定为樟科植物肉桂的干燥树皮;细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)购自天津百萤生物科技有限公司;Gibco16010-078小牛血清购自上海素冉生物科技有限公司;DMEM高糖完全培养基[含10%胎牛血清(FBS)]购自上海雅吉生物科技有限公司,使用时稀释为5%FBS的DMEM培养基;TRN zol A+试剂购自天根生化科技(北京)有限公司;One Step Prime ScriptTMRT-PCR Kit购自TAKARA Biotechnologies公司;分析纯硫酸铜(CuSO4)购自天津化学试剂三厂;分析纯三氯化铁(FeCl3)、氯化钾(KCl)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)和磷酸氢二钠(Na2HPO4)均购自西陇化工股份有限公司;分析纯盐酸(HCl)购自汕滇药业有限公司;鼠用配合饲料购自浙江科力饲料有限公司;0.1%新洁尔灭消毒液购自江西草珊瑚消毒用品有限公司;0.5%过氧乙酸消毒液购自福建维真园医药科技有限公司.实验所用水(H2O)均为蒸馏水.

使用美国Molecular Devices公司生产的Spectra Max 340 PC 384型酶标仪进行溶液吸光度的测定;使用丹佛仪器有限公司UB-7型pH计测量溶液pH;使用腾泉生命科技有限公司的Acumen eX3血细胞分析仪检测小鼠血凝抑制效价(抗体水平);使用美国Life Technologies公司的ABI 7500 Real-Time PCR仪进行逆转录-聚合酶链(RT-PCR)反应;使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的二氧化碳(CO2)培养箱进行细胞培养;使用梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司的METTLER TOLEDO MS电子天平称量试剂;使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的Thermo Biofuge Stratos高速冷冻离心机进行溶液的离心;使用江南光学仪器厂的XD-202型光学显微镜进行细胞观察.

1.2 研究对象

雌性28～30日龄C57BL/6近交系小鼠由中国医学科学院医学生物学研究所实验动物中心提供.将小鼠分为3组:健康空白组、对照组和实验组,每组8只.小鼠每日喂饲鼠用配合饲料,自由饮水,隔日更换垫料;动物房控制温度为(20.0±2.0)℃,相对湿度45.0% ～50.0%,换气次数为每小时10～20次,气流速度0.1～0.2 m/s,噪音≤60 dB,工作光照强度150～300 lx,明、暗照明交替时间为12 h;动物房每周消毒2次,消毒剂以0.1%新洁尔灭和0.5%过氧乙酸交替使用.本研究涉及的动物病毒攻击(以下简称攻毒)保护实验方案严格按国家实验动物指南设计,并得到中国医学科学院医学生物学研究所动物伦理委员会批准(审批号:2015-03).

1.3 KPC-rg1制备

将200.0 g肉桂干燥树皮经粉碎后置于10倍质量的H2O(2.0 L)中20.0℃浸泡提取,滤液浓缩后加入 KCl至终浓度 0.5 mol/L并用 HCl调至pH 4.0,室温静置后取沉淀减压干燥得KPC-rg1.取干燥至恒质量的KPC-rg1样品100.0 mg,以配制的磷酸缓冲盐(PBS)溶液进行溶解并定容至100.0 mL,得终质量浓度为1.00 mg/mL的KPC-rg1溶液;从中分别取20.0、12.5和2.5 mL放至25 mL的容量瓶中,以PBS溶液定容得KPC-rg1质量浓度为0.80、0.50和0.10 mg/mL的溶液;再从质量浓度为0.10 mg/mL的溶液中分别取5.0和1.0 mL放至10 mL的容量瓶中,以PBS缓冲液定容得KPC-rg1质量浓度为0.01和0.05 mg/mL的溶液.

取干燥至恒质量的KPC-rg1样品800.0 mg,以PBS溶液进行溶解并定容至100.0 mL,得终质量浓度为8.00 mg/mL的KPC-rg1溶液备用.

1.4 KPC-rg1细胞不良反应实验

取Vero细胞铺96孔板,每孔铺细胞液100.0 μL,在37.0℃、5.0%CO2培养箱过夜培养,至单层铺满后,于预设定的孔内加入5.0 μL不同质量浓度的KPC-rg1溶液使之形成药物质量浓度梯度,作为实验组;于预设定的孔内加入 5.0 μL的PBS溶液作为对照组;于未接种细胞的孔内加入等体积的培养液[DMEM培养基(5%FBS)100.0 μL]和溶剂(PBS 5.0 μL),作为空白组,即 KPC-rg1的质量浓度为0.将96孔板置于培养箱中培养48 h后,使用 CCK-8检测不同质量浓度下,入射光为570 nm时的吸光度(A)值,根据A值计算细胞存活率(P),公式如下[19]:

P=[(A2-A1)/(A0-A1)]×100%,

式中A0、A1和A2分别是空白组、对照组和实验组的吸光度.

1.5 H1N1流感病毒溶液制备

将H1N1流感病毒稀释液混合到经复苏传代的Vero细胞悬液中,共同孵育进行流感病毒的繁殖并收集[20].使用PBS溶液将H1N1流感病毒原溶液稀释至预定的滴度(29 HAU/50.0 μL)备用.

1.6 H1N1流感病毒攻毒实验

健康空白组:每只小鼠左鼻内接种 50.0 μL PBS缓冲液;对照组:取24.4 μL病毒稀释液,加入25.6 μL PBS 溶液,得到250 HAU/50.0 μL 的 H1N1流感病毒溶液,每只小鼠左鼻内接种50.0 μL H1N1流感病毒溶液;实验组:取24.4 μL病毒稀释液加入12.5 μL的8.0 mg/mL KPC-rg1 溶液,再加 13.1 μL PBS缓冲液,37.0℃、5.0%CO2培养箱中温育5～10 min,得到250 HAU/50.0 μL的H1N1流感病毒+2.0 mg/mL的KPC-rg1混合稀释液,每只小鼠左鼻内接种50.0 μL混合溶液.接种过程中不麻醉.

1.7 小鼠体质量变化及存活率

观察并记录小鼠28 d体质量变化和存活情况.体质量增长指数(w)为从实验开始之日起每隔2～3 d对每只小鼠进行精确称体质量(mi)至实验结束或动物死亡.小鼠的w和存活率(r)计算公式如下:

w=mi/m0,

r=(ni/n0)×100%,

式中m0为首次体质量,ni为第i天存活只数,n0为起始只数.

1.8 小鼠血凝抑制效价(抗体水平)

本研究使用Hirst[21]的方法确定小鼠左鼻接种后抗H1N1流感病毒抗体产生情况,即使用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量.在培养28 d后,采集眼球血清,每只小鼠采血0.2～0.3 mL,根据国家流感中心标准操作规程进行红细胞凝集抑制实验(HI),检测小鼠血清中针对H1N1流感病毒的 HI效价[22].血凝抑制结果≥20 HAU为阳性有效HI效价.

1.9 小鼠肺部病毒载量检测

实验各设平行组,给药第3和28天,处死平行组中的任何一组,获取小鼠的肺,研磨制备匀浆后利用TRN zol A+试剂提取总RNA.利用紫外-可见分光光度计进行定量测定样品RNA浓度.每100 ng总RNA逆转录为cDNA并进行RT-PCR定量检测病毒载量.检测引物针对H1N1流感病毒M基因编码区进行设定,序列如下:

FluA-F GACCAATCCTGTCACCTCTGAC,

FluA-R AGGGCATTTTGGACAAAGCGTCTA,

Flu-probe(FAM)-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-(BHQ1).

1.10 数据统计学处理

2 实验结果

2.1 KPC-rg1细胞不良反应实验

当 KPC-rg1溶液质量浓度为 0.01、0.05、0.08、0.10、0.50、0.80 和 1.00 mg/mL 时,Vero细胞存活率分别是 89.3%、84.1%、82.7%、78.4%、26.9%、20.6%和19.2%.即细胞培养48 h后,与 KPC-rg1质量浓度为 0相比,0.50、0.80和 1.00 mg/mL时Vero细胞的存活率明显低于 100%(t=0.017、0.048和 0.025,P＜0.05);而质量浓度为 0.01、0.05、0.08和0.10 mg/mL时,KPC-rg1对 Vero细胞生长无明显的不良反应(P＞0.05).因此,将KPC-rg1质量浓度为0.10 mg/mL作为本实验小鼠攻毒保护实验时剂量设计的基础.

2.2 小鼠存活率和体质量变化

H1N1流感病毒攻毒后,各组小鼠的w和r变化情况如图1所示.健康空白组小鼠无死亡现象,小鼠平均体质量随喂养时间的延长有一定的增长(23.5～26.8 g);对照组小鼠接受攻毒后,在第3天出现死亡,第3～5天,小鼠体质量急剧下降(14.5～18.9 g),至第 7天仅存活 3只,即r=37.5%;第6天开始,存活小鼠体质量也有一定的增长(15.8～29.3 g);实验组小鼠无死亡现象,小鼠接受攻毒后2 d内平均体质量略微下降(20.2～20.5 g),之后恢复到正常增长水平,且喂养第10天后小鼠平均体质量略高于健康空白组(27.3～30.6 g);对各组小鼠最终平均体质量进行组间t检验比较,各组之间平均体质量差异无统计学意义(P＞0.05),说明小鼠自身免疫抵抗及KPC-rg1预防H1N1流感病毒对存活小鼠最终体质量不会产生显著性影响.通过小鼠体质量变化和生存率结果推测KPC-rg1可以在短时间内,即病毒与 KPC-rg1混合温育的过程中(5～10 min)将H1N1流感病毒灭活,起到预防H1N1流感病毒的作用.

3组小鼠接受攻毒后第15天鼻部变化如图2所示,健康空白组和实验组小鼠均未出现鼻毛脱落的现象,而对照组存活小鼠鼻毛出现严重的脱落现象,脱落面积约20.0% ～33.3%.

图1 H1N1攻毒后各组小鼠基本情况

图2 小鼠接种后第15天鼻部变化

2.3 小鼠血凝抑制效价(抗体水平)检测

小鼠攻毒后28 d,对照组和实验组小鼠血清中均检测出高滴度的血凝抑制效价,2组HI效价均为128 HAU,表明H1N1流感病毒对小鼠的攻击使小鼠免疫系统产生了相应抗体和保护性.对照组存活动物血清出现高滴度的血凝抑制效价属于天然免疫所致,而实验组小鼠的血凝抑制效价特征则属于人工免疫的结果.这提示 KPC-rg1与 H1N1流感病毒的接触使病毒失去攻击活性,还有可能保留了病毒完整的中和免疫原性.

2.4 小鼠肺部病毒载量检测

对攻毒3 d后的小鼠肺组织进行病毒载毒量分析,对照组和实验组小鼠肺部病毒载量均达到1×107copies/50 mg(1 IU≈5.6 copies)肺组织,表明攻毒后小鼠肺部受到严重感染.在第28天对19只存活小鼠的肺组织进行载毒量分析,在肺组织没有发现残留病毒,表明体内病毒已被小鼠免疫系统有效清除.

综上所述,通过鼻黏膜点样感染H1N1流感病毒的小鼠均发生了肺部感染,对照组小鼠在攻毒后7 d内死亡率为62.5%,存活的3只小鼠在感染后第15天出现了严重的鼻毛脱落症状;而实验组在攻毒后2 d出现体质量不增长或降低现象,但7 d后恢复正常增长状态,动物的r=100%,且没有出现鼻毛脱落现象.针对H1N1流感病毒的血凝抑制实验及肺部病毒载量分析结果表明,实验组小鼠在攻毒后产生了强烈的免疫应答反应,使机体产生高滴度的抗病毒抗体,这可能是小鼠清除病毒的关键机制.本研究数据提示 KPC-rg1对 H1N1流感病毒有一定的灭活作用,可用于抗浅表皮病毒感染用药研制,这也为下一步探索KPC-rg1处理后病毒中和抗原的完整性以及可能的病毒灭活疫苗的制备研究打下基础.

3 结束语

本研究显示KPC-rg1对H1N1流感病毒的灭活作用不但强大,而且推测可以在短时间内(室温下温育5 min)即可达到病毒的完全失活效果,对小鼠有显著的保护预防作用;被灭活的病毒保留了完整的抗原性,形成了“原位固化灭活”效应;KPC-rg1可促使小鼠产生强烈的免疫应答反应,使机体产生高滴度的抗病毒抗体.

除此之外,本研究组还开展了 KPC-rg1对H3N2流感病毒、单纯疱疹(HSV-1)病毒、人巨细胞(HCMV)病毒和HIV病毒等也有显著的灭活作用研究,研究结果证明KPC-rg1具有相当广谱的抗病毒作用[18].

鉴于KPC-rg1具有的快速、强大和广谱的病毒灭活作用特点,对KPC-rg1进一步研发极有可能使其发展成为制备包括流感病毒在内的多种病毒灭活疫苗制备所必须的新型病毒灭活材料,也可用于治疗各种包膜类病毒感染的皮肤类用药的研制.

致谢：感谢中国医学科学院医学生物学研究所李琦涵、刘龙丁和陈元鼎3位教授对本研究进行的指导.