PD-1及其配体在器官缺血再灌注损伤中的作用

李春喜，吴友平，屠伟峰

(1.武装警察部队北京市总队医院麻醉科，北京100027； 2.驻香港部队医院手术室，香港 999077；3.解放军南部战区总医院麻醉科，广州 510010)

缺血再灌注损伤是指组织器官缺血后再灌注并不能使组织器官功能恢复，反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤。缺血再灌注损伤常发生于严重创伤、失血性休克、心搏骤停复苏及器官移植手术后。关于缺血再灌注损伤的作用机制尚未完全阐明，目前认为氧自由基的作用、细胞内钙超载、白细胞激活和细胞凋亡等均是导致缺血再灌注损伤的重要病因[1]，但是否还存在其他机制尚不清楚。由于发病机制复杂，目前对缺血再灌注损伤尚无有效的治疗手段。免疫反应介导的机制在缺血再灌注损伤中的作用越来越受到重视。T细胞参与的特异性免疫反应可能在再灌注后晚期发挥作用[2]。共刺激分子程序性细胞死亡受体1(programmed cell death protein 1，PD-1)及其配体PD-L(programmed cell death-ligand)1、PD-L2广泛分布于各种免疫细胞，是体内重要的免疫调节分子[3]。PD-1与其配体结合不仅参与外周组织的免疫耐受，而且在肿瘤免疫、器官移植及多种感染性疾病中有巨大作用[4]。新近的研究发现，PD-1及其配体在器官缺血再灌注损伤中也具有非常关键的作用[5]。现就近年来国内外关于PD-1及其配体在肠、脑、肾脏、心脏和肝脏等不同器官缺血再灌注损伤中的作用及机制予以综述。

1 PD-1及其配体的表达与功能

PD-1是B7-CD28家族的一员，包含一个免疫受体酪氨酸的抑制基序和一个免疫受体酪氨酸开关基序，是由CD4+和CD8+T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、单核细胞及一些树突状细胞亚群等多种活化的免疫细胞共同表达的一种抑制性受体[3]。PD-L1和PD-L2是PD-1的两个已知配体，它们具有不同的表达模式。PD-L1在小鼠淋巴样细胞(如T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞、间充质干细胞和骨髓源性肥大细胞)上有组成性表达，在非造血细胞中也有表达；PD-L2的表达仅限于巨噬细胞、树突状细胞、骨髓源性肥大细胞和腹膜B1细胞[3]。

PD-1与其配体结合后引起胞质区酪氨酸残基磷酸化，在T细胞的激活过程中传递负性共刺激信号，进而抑制淋巴细胞增殖和细胞因子产生，促进淋巴细胞凋亡；另外，PD-1及其配体广泛参与外周组织的免疫耐受，以PD-1及其配体为靶点的免疫调节治疗对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及移植器官存活等均具有重要意义[6]。

2 器官缺血再灌注损伤的机制

缺血再灌注损伤是指组织器官缺血后再灌注并不能使组织器官功能恢复，反而加重组织器官的功能障碍和结构损伤。缺血再灌注损伤的发病机制复杂，包括氧自由基的作用、细胞内钙超载及白细胞的作用和细胞凋亡等[1]，但任一机制均不能完全解释器官缺血再灌注损伤的原因，是否存在其他的机制目前尚不清楚。

免疫反应介导的机制在缺血再灌注损伤中的作用越来越受到重视[7-8]。一般认为，在再灌注后早期，抗缺血再灌注损伤的组织免疫反应是以非特异性免疫反应为主的炎症反应，而以T细胞激活为标志的特异性免疫反应在再灌注后晚期发挥作用；活化的T细胞通过两种主要的机制发挥功能，即分泌细胞因子和细胞表面共刺激分子表达[2]。PD-1及其配体作为一种重要的共刺激分子，在缺血再灌注损伤中的作用得到越来越多的重视和研究。

3 PD-1/PD-L途径在不同器官缺血再灌注损伤中的作用

3.1PD-1/PD-L途径与肠缺血再灌注损伤 临床上，肠缺血再灌注损伤通常发生在急性肠系膜缺血、严重创伤、出血性或感染性休克以及较大的外科手术之后[9]。肠缺血再灌注损伤引起肠道防御屏障受损，严重者可引起菌群失调以及细菌移位，并导致进展性远端器官损害和多器官功能障碍综合征而危及患者生命。肠道是人体最大的免疫器官，已有研究发现，肠上皮细胞作为非专职抗原呈递细胞，可以表达PD-L1分子，与肠上皮间淋巴细胞相互作用，调节肠道免疫、影响肠道屏障功能；肠上皮细胞表达PD-L1在脓毒症导致的肠屏障功能损伤中起重要作用[10]。关于PD-1及其配体与肠缺血再灌注损伤的关系，研究发现，脂肪间充质干细胞制成的单细胞悬液能够保护小鼠肠缺血再灌注损伤，而抗PD-L1单克隆抗体处理能消除脂肪间充质干细胞单细胞悬液对小鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用，提示PD-L1/PD-1信号通路在小鼠肠缺血再灌注损伤中有保护作用[11]。肠缺血再灌注破坏肠黏膜完整性和免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)A的产生。有研究表明，PD-1在调节肠道分泌型IgA中起重要作用[12]。另有研究观察到小鼠肠缺血再灌注后Peyer′s结CD4+T细胞PD-1和PD-L1表达减少，且PD-1/PD-L1表达减少与肠黏膜损伤增加和IgA水平降低有关；肠缺血再灌注抑制Peyer′s结CD4+T细胞表达PD-1/PD-L1，这种抑制作用与肠道免疫系统和机械屏障功能受损有关，提示CD4+T细胞表达PD-1/PD-L1可能参与肠缺血再灌注损伤的发病机制；这个结果与癌症或脓毒症一般增加PD-1/PD-L1表达不同，缺血再灌注损伤抑制PD-1系统，表明PD-1通路的激活可能减轻缺血再灌注损伤[13]。白细胞介素(interleukin，IL)-10是一种具有广泛免疫调节功能的细胞因子，主要由单核细胞和CD4+T淋巴细胞产生；此外，IL-10通过抑制微RNA(microRNA，miRNA/miR)-155调节激活诱导的胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase，AID)，而AID是肠道Ig合成和抗菌功能的关键酶[14]。PD-1激活能调节IL-10释放。研究发现，肠缺血再灌注损伤导致PD-1表达减少、IgA、IgM的细菌结合能力受损，PD-L1融合Ig可激活PD-1，促进IL-10合成，降低miR-155水平，促进AID表达，降低了肿瘤坏死因子-α、IL-1β水平，改善了IgA、IgM功能障碍引起的肠免疫屏障的破坏[5]。该研究结果首次证实肠缺血再灌注损伤后PD-1的激活可能通过调节IL-10/miR-155的产生而改善肠道免疫功能障碍。上述研究不仅证实了PD-1及其配体在肠道缺血再灌注损伤中的作用，也为缺血再灌注损伤引起肠屏障和免疫功能损害提供了新的潜在治疗靶点。

3.2PD-1/PD-L途径与脑缺血再灌注损伤 大脑是人体最重要的器官，也是对缺氧最为敏感的器官。脑缺血再灌注损伤是急性缺血性脑卒中重要的病理生理机制之一。缺血性脑卒中发病机制复杂，可诱导涉及多种免疫细胞的局部炎症反应。一般来说，脑内炎症免疫细胞的聚集加重了脑卒中的严重程度，这一过程在一定程度上依赖于T细胞的活化[15]。针对淋巴细胞黏附受体的抗体能阻断T细胞迁移，并减小大鼠短暂性大脑中动脉闭塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)后第1天的脑梗死体积[16]。但T细胞通过何种机制参与缺血性脑卒中的病理生理过程尚不清楚，其中B7家族共刺激分子可能起着关键性的作用。Kleinschnitz等[17]最早用T细胞受体(T-cell receptor，TCR) 转基因小鼠和共刺激分子突变小鼠确定了T细胞介导缺血再灌注脑损伤的最低免疫需求，结果发现，与野生型小鼠相比，完全缺乏成熟T细胞和B细胞的RAG1-/-小鼠和B细胞重建的RAG1-/-小鼠在60 min tMCAO和再灌注24 h后，脑梗死体积显著减小，且缺血性脑卒中急性期T细胞的有害作用与T细胞驱动的获得性免疫机制无关；与TCR的作用类似，无CD28、PD-L1和PD-1表达的小鼠在tMCAO后24 h的脑梗死体积及神经功能缺损与野生型动物相当，表明通过PD-1/PD-L1或CD28/B7途径的辅助TCR信号对于早期脑卒中的进展也不是必需的；该研究认为，T细胞在缺血性脑卒中中起关键作用，其有害作用在脑卒中早期不依赖于抗原识别，也不依赖于TCR共刺激信号。与此结果相反，随后的另一项研究发现，PD-1通路在限制脑梗死体积、从周围募集炎症细胞、激活巨噬细胞和中枢神经系统小胶质细胞以及神经功能缺损等方面有调节作用；该研究认为，PD-1信号通路是大脑缺血再灌注损伤后限制中枢神经系统炎症反应的主要保护途径，这一抑制通路可能在减少脑卒中相关的Toll样受体(Toll like receptor，TLR)2和TLR4介导的中枢神经系统小胶质细胞激活并释放神经毒性因子中起关键作用[18]。然而，对于PD-L，有研究发现，PD-L1-/-和PD-L2-/-小鼠的总梗死体积小于野生型小鼠，PD-L1-/-和PD-L2-/-小鼠可降低缺血脑半球具有促炎活性的小胶质细胞和(或)单核细胞及CD4+T细胞的浸润水平；在缺乏PD-L1的情况下，与缺血相关的脾萎缩减少，同时脾脏T细胞和单核细胞的激活状态降低，表明PD-L在脑缺血再灌注损伤中具有致病作用而不是保护作用[19]。

缺血性脑卒中后不久，血浆和脑中性粒细胞源性的基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)水平升高，MMP-9通过降解细胞外基质破坏血脑屏障。研究发现，过继转移调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)通过抑制MMP-9减轻急性缺血性脑损伤和保护血脑屏障[20]。但Treg细胞与中性粒细胞相互作用的具体机制尚不清楚。Li等[21]评估了PD-L1在脑缺血再灌注损伤后Treg细胞介导的中性粒细胞抑制和神经保护中的作用，通过在体和体外研究证实PD-L1通过介导Treg细胞对中性粒细胞源性MMP-9的抑制作用，在Treg细胞抗脑缺血再灌注损伤的神经保护中起重要作用。上述研究的不同结果表明，PD-1/PD-L途径对脑缺血再灌注损伤的作用尚存在争议，不同细胞表达的特异性作用可能是存在不同作用的原因之一，需要更多的研究阐明其机制。

3.3PD-1/PD-L途径与肾缺血再灌注损伤 急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)在住院患者中有较高的发病率和病死率，增加了慢性肾脏病和终末期肾脏病发生的可能性。肾缺血再灌注损伤是AKI发生的主要原因之一，其特点是肾脏炎症失控和肾小管上皮细胞死亡。研究发现，在小鼠肾缺血再灌注损伤模型中，Treg细胞减少导致肾脏非特异性免疫反应和急性肾小管坏死(acute tubular necrosis，ATN)增加以及肾脏功能丧失[22]，相比之下，缺血前增加Treg细胞能保护肾脏免受炎症和ATN侵害，并能保护肾功能[23]。但Treg细胞移植与肾缺血再灌注损伤相关的非特异性免疫反应机制目前尚不清楚。Treg细胞表达CD73，CD73是参与细胞外腺苷生成的最后一种酶，腺苷通过激活免疫细胞上的腺苷2A受体抑制炎症反应，保护缺血再灌注后的肾功能[24]。Kinsey等[25]研究发现，Treg细胞同时产生和应答腺苷的能力是其抑制肾缺血再灌注损伤非特异性免疫反应所必需的，Treg细胞通过自分泌的方式增加PD-1表达，进而抑制非特异性免疫反应，保护肾缺血再灌注损伤，该研究首次揭示了PD-1与肾缺血再灌注损伤的关系。随后，有研究发现，在轻、中度肾脏缺血再灌注前使用PD-L1或PD-L2阻断抗体可显著加重肾功能损伤、肾脏炎症和ATN，两种配体同时阻断较单独阻断任何一个配体会导致更严重的肾损伤；PD-L1或PD-L2基因缺陷也会加重缺血再灌注后的肾功能障碍和ATN，PD-L1在非骨髓来源的细胞上表达是其保护肾缺血再灌注损伤的关键，而且阻断PD-L1或PD-L2同样可逆转过继转移Treg细胞对肾缺血再灌注损伤的保护作用[26]。这些结果提示，与PD-1一样，PD-L1和PD-L2在肾缺血再灌注损伤的自身保护反应方面至关重要，可能是AKI新的治疗靶点。

3.4PD-1/PD-L途径与心肌缺血再灌注损伤 心血管疾病常年处于人类致死性疾病的首位，尤其是心肌梗死，具有高病死率和心力衰竭发生风险，关键病理因素之一就是心肌梗死患者在血运重建治疗中伴随的心肌缺血再灌注损伤。心肌缺血再灌注损伤指冠状动脉部分或完全急性阻塞后，在一定时间又重新获得再通时，缺血心肌虽然得以恢复正常灌注，但其组织损伤反而呈进行性加重的病理过程。缺血期引起的心肌超微结构、能量代谢、心功能和电生理等一系列损伤性变化，在血管再通后表现得更为突出，甚至可发生严重的心律失常而导致猝死。

关于PD-1/PD-L通路与心肌缺血再灌注损伤的关系，Forteza等[27]分析了PD-1/PD-L通路在ST段抬高型心肌梗死中的作用，发现外周血单个核细胞中PD-1的表达水平先升高后降低，且PD-1在心肌梗死区的表达显著增加，提示PD-1可能在T细胞的转运和对心肌损伤的影响中起调节作用；研究还发现，在外周血单个核细胞中，心肌梗死面积与PD-1的表达显著相关，心肌梗死范围越大，PD-1表达下调越严重，提示PD-1通路激活可能对缺血再灌注心肌具有保护作用。该研究首次发现了PD-1在下调ST段抬高型心肌梗死急性炎症反应中的作用。

内源性炎症机制是导致心肌损伤的重要原因。生长停滞和DNA损伤诱导蛋白153(growth arrest and DNA damage inducible protein 153，GADD153)可调节心脏炎症反应和心肌细胞凋亡，GADD153的表达与心肌损伤有关[28]。Baban等[29]研究发现，离体缺血再灌注心肌细胞PD-1和PD-L1的表达显著增加，但免疫荧光研究显示，PD-1和PD-L1并非主要在同一心肌细胞上共同表达；PD-1/PD-L1表达上调与GADD153和IL-17水平显著升高、IL-10水平轻度升高有关，也与线粒体膜电位中断以及细胞凋亡有关，PD-L1阻断抗体治疗能逆转上述改变，表现出显著的心脏保护作用；此外，缺血再灌注心肌细胞能抑制T淋巴细胞增殖，这一作用也可被PD-L1抗体部分逆转。该研究结果表明，心肌缺血再灌注时PD-1/PD-L1通路上调可能通过旁分泌机制介导心肌组织损伤。缺血再灌注心肌细胞抑制T细胞增殖与PD-1/PD-L1途径的负性免疫调节作用相一致，反映了心脏通过抑制浸润的免疫细胞减轻心肌损伤的一种内源性机制，这一机制作用的强弱可能决定了心肌损伤的程度。

3.5PD-1/PD-L途径与肝缺血再灌注损伤 肝缺血再灌注损伤是一种外源性抗原非依赖性的炎症事件，可发生在多种临床环境中，包括部分肝切除、肝脏创伤和肝移植等。肝缺血再灌注损伤仍然是肝移植患者最严重的问题之一，不仅可造成10%的早期移植失败，还可导致较高的急性和慢性排斥反应发生率，并导致肝脏供体的急性短缺[30]。

研究发现，CD4+T细胞介导了非特异性免疫反应主导的肝脏缺血再灌注损伤[31]，但具体机制目前尚不清楚。Ji等[32]利用小鼠部分肝脏热缺血再灌注模型，发现阻断PD-1信号通路会加重缺血再灌注后肝细胞的损伤，而激活PD-1信号通路可保护肝脏免受缺血再灌注侵害，其作用机制包括减少肝内T淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞浸润及激活，减少细胞凋亡，减少促炎症趋化因子和细胞因子的基因表达而选择性增加抗炎症细胞因子IL-10的表达等；研究还发现，中和IL-10不仅能导致肝缺血再灌注损伤，还可逆转PD-L1 Ig对肝缺血再灌注损伤的治疗作用；该研究首次证实了PD-1/PD-L1通路在肝缺血再灌注损伤中的重要作用，刺激PD-1信号通过抑制T细胞活化和库普弗细胞/巨噬细胞功能而改善肝脏缺血再灌注损伤；PD-1对T细胞-库普弗细胞相互作用的负性协同刺激机制可能是通过减少器官损伤和促进IL-10依赖的细胞保护作用来维持肝脏的稳态。

Ueki等[33]利用PD-L1基因敲除小鼠，在肝脏冷缺血再灌注损伤模型中发现，移植肝组织PD-L1的表达在肝缺血再灌注损伤过程中起着重要的调节作用；临床移植肝组织标本分析也显示，PD-L1在人体移植肝上的表达与正常肝组织相比显著增加[33]。由此认为，移植肝PD-L1的表达在移植肝冷缺血再灌注损伤中通过调节非特异性免疫反应起重要的保护作用。

4 小 结

随着对PD-1/PD-L1作用机制研究的不断深入，发现PD-1/PD-L1作为免疫检查点抑制剂用于肿瘤免疫治疗是目前肿瘤治疗领域最有前景的研究方向[34]，而对PD-1/PD-L1在器官缺血再灌注损伤中的作用尚处于实验研究阶段。通过观察PD-1/PD-L1在器官缺血再灌注损伤时的表达变化、使用基因敲除小鼠、PD-L1 Ig激活或单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1通路等多种方式证实PD-1/PD-L1可通过调节免疫和炎症反应减轻器官的缺血再灌注损伤，但目前相关机制研究尚不深入，且在心肌梗死及缺血性脑卒中发病机制中的作用还存在争议，尚需更多的实验和临床研究证实其作为器官缺血再灌注损伤治疗靶点的可能。