mTOR复合物在细胞迁移中的作用*

阿春仙，金晓丽，袁淑琴，赵三军

(云南师范大学 生命科学学院，云南 昆明 650500)

细胞迁移是细胞普遍存在的一种运动方式，在生物的个体发育、组织再生、伤口愈合及免疫防御等过程中具有重要意义.细胞迁移大致概括为以下四个物理过程：(1)细胞膜向前端伸出形成板状伪足；(2)伪足和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)形成新的细胞黏着；(3)在肌动蛋白和肌球蛋白影响下，细胞收缩后整体异位；(4)尾端和周围基质脱离，细胞向前运动[1].大量的研究结果表明，细胞骨架的动态组装、黏着斑、整合素、黏着斑激酶、丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和Rho GTP酶(Rho GTPases)在细胞迁移中发挥十分重要的作用.

细胞迁移调控异常会导致发育异常、伤口难愈、血管疾病和肿瘤恶性转移等诸多疾病，因此必须确保迁移过程的时空准确性.细胞外信号通过受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)和G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)信号转导通路提供时空信息，指导细胞骨架元素的重排，建立细胞极性，调节细胞迁移[2].此外，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)和磷脂酶C(phospholipase C，PLC)等许多信号通路都参与了细胞定向迁移的调控[3].

越来越多的研究发现，在哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)广泛信号通路中，mTOR复合物能通过下游的效应蛋白将细胞迁移信号传递给细胞骨架以及细胞骨架调控相关蛋白，其在调节细胞迁移过程中发挥的作用不可忽视.为了更深入地了解mTOR复合物在细胞迁移过程中的作用，对mTOR复合物的组成和它们在细胞迁移中的作用的最新研究进行系统阐述，为后续研究提供参考.

1 mTOR复合物的介绍

1.1 mTORC1和mTORC2的构成

mTOR也称为西罗莫司效应蛋白(sirolimus effector protein，SEP)，分子量为289 kDa，由定位于染色体1p36.2的单个基因编码.mTOR作为雷帕霉素的机制靶点，是从酵母到哺乳动物细胞都普遍存在，在结构和功能上高度保守的丝氨酸/苏氨酸(serine/threomine，Ser/Thr)激酶，属于PI3K相关激酶家族.mTOR蛋白具有复杂的结构域(图1)，从氨基端到羧基端依次排列为： 20个串联重复序列(HEAT repeats)、FAT域(focal adhesion targeting domain)、FRB域(FKBP12-rapamycin binging domain)、激酶结构域(kinase domain)、阻遏物域(repressor domain)和FATC域(focal adhesion targeting domain of C-terminal)[4-5].

mTOR在细胞内主要通过与其他蛋白质分子相互作用形成多蛋白复合体发挥作用，根据对雷帕霉素是否敏感，mTOR复合物分为对雷帕霉素敏感的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)和对雷帕霉素不敏感的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2 (mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2).mTORC1和mTORC2在结构上既有相同的组分，又有各自特有的组分(图1).mTOR、哺乳类LST8同源蛋白(mammalian lethal with Secl 3 protein 8，mLST8，又名GβL)、含DEP结构域的mTOR结合蛋白(DEP-domain-containing mTOR-interacting protein，Deptor)均存在于mTORC1和mTORC2中.mTORC1特有的组分包括mTOR调节相关蛋白(regulatory associated protein of mTOR，Raptor)、富含脯氨酸的AKT底物蛋白(proline-rich substrate of AKT of 40 kDa，PRAS40)；mTORC2特有的组分包括雷帕霉素不敏感性伴随蛋白(rapamycin-insensitive companion of mTOR，Rictor)、哺乳动物压力活化蛋白激酶相互作用蛋白1(stress-activated protein kinase-interating protein，mSin1)、热休克蛋白70(heat shock protein，Hsp70)和Protor(protein observed with Rictor)[6-7].mTORC1中各组分的具体作用为：(1)Raptor最为重要，负责调节复合物的组装和招募底物；(2)mLST8作为mTORC1的信号接收器；(3)PRAS40和Deptor通过负反馈调节的方式影响mTORC1的活性.mTORC2中各个组分的具体作用为：(1)Rictor最为重要，mTORC2的组装、稳定性、底物识别和亚细胞定位均需要Rictor的参与，Rictor缺失将导致mTORC2无法发挥激酶活性；(2)mSin1与Rictor相互作用，维持mTORC2的结构完整性[8]；(3)Deptor是mTORC2的内源性抑制剂；(4)mLST8参与维持mTORC2的激酶活性以及复合物的结构稳定性；(5)Protor是Rictor的结合组件，现有研究显示它对mTORC2组装和催化无影响[9-10].

图1 mTORC1和mTORC2复合物

1.2 mTOR复合体的上下游调控分子

除了特异性结合组分和对雷帕霉素的敏感性不同，mTORC1与mTORC2在响应调控分子方面也存在差异(图1).mTORC1对雷帕霉素、氧气、氨基酸、压力、葡萄糖及生长因子等多种上游调控分子做出响应，主要参与形成PI3K/AKT/mTORC1和LKB1/AMPK/TSC/mTORC1两条信号通路[4,11].这里以PI3K/AKT/mTORC1信号通路为例进行阐述：上游调控因子如表皮生长因子受体(pidermal growth factor receptor，EGFR)接收外界信号刺激使细胞内的PI3K活化，活化的PI3K使磷脂酰肌醇2-磷酸(phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate，PIP2)转化成磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate，PIP3)，进而通过磷脂酰肌醇依赖性激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1，PDK1)和磷脂酰肌醇依赖性激酶2 (phosphoinositide-dependent kinase 2，PDK2)以磷酸化方式激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或称为AKT)，正向调控mTORC1的功能[12].活化的mTORC1主要通过调控下游的两个经典效应分子——核糖体蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6K1)和真核翻译起始因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiaton factor 4E-binding protein 1，4E-BP1)来控制蛋白质的翻译，从而调节细胞生长和增殖[13].

与mTORC1相比，对mTORC2的研究起步较晚.mTORC2的上游调控因子主要是生长因子和葡萄糖，mTORC2通过磷酸化激活方式调节下游的血清和糖皮质激素调控激酶(serum/glucocorticoid regulated kinase-1，SGK)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、I型胰岛素样生长因子受体(type I insulin-like growth factor receptor，IGF-IR)和AKT，从而调控细胞存活、营养代谢、细胞骨架重排和细胞迁移[14-15].AKT在细胞周期进展、葡萄糖代谢、基因组稳定性、转录、蛋白合成和新生血管形成等过程中起关键作用，AKT的完全激活需要两个位点的磷酸化：一个是Ser308，该位点可通过PDK1磷酸化激活；另一个位点为Ser473，该位点可通过mTORC2激活，mTORC2成分敲除会阻止AKT在Ser473位点磷酸化，并抑制AKT下游部分底物的磷酸化[16-17].

2 mTOR复合体在细胞迁移中的作用

细胞迁移的过程涉及细胞骨架蛋白的动态组装、细胞和细胞外基质间黏着的变化、周围基质的重塑等，越来越多的研究证实mTOR复合物在以上过程中发挥重要作用(见图2).mTORC1主要通过调控迁移相关基因的表达和翻译来调节迁移，而mTORC2主要通过调控影响细胞骨架动态组装的相关蛋白的激活来调节迁移.

图2 mTOR复合物在细胞迁移中的作用

2.1 mTORC1对细胞迁移的影响

2.1.1 mTORC1通过调控S6K1调节细胞迁移

S6K1属于AGC激酶家族，是一个保守的Ser/Thr激酶.mTORC1调节S6K1从而调控细胞迁移的方式主要有4种：(1)促进肌动蛋白重构：mTORC1活化S6K1后可促进肌动蛋白丝重构，从而促进细胞迁移.早期对主动脉平滑肌细胞的研究发现，雷帕霉素抑制纤连蛋白诱导的mTORC1和S6K1的活化，并显著降低平滑肌细胞对纤连蛋白的趋化性[18].Berven等的研究结果也显示，在小鼠Swiss3T3细胞迁移的过程中，激活的S6K1、AKT、PDK1、p85、PI3K和mTOR等蛋白定位于正在迁移的细胞的伪足前缘肌动蛋白弧[19].(2)影响黏着斑的形成：mTOR的激酶活性对于F-肌动蛋白重组和黏着斑蛋白的磷酸化至关重要，mTOR-raptor复合体被破坏后，胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-Ι，IGF-I)诱导的F-肌动蛋白(F-actin)重组和黏着斑形成相关蛋白的磷酸化会被抑制[20].(3)影响细胞外基质重组：基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)介导细胞外基质重组，在抗沉默功能的1B组蛋白伴侣基因(ASF1B)过表达的人肾透明细胞腺癌细胞(786-O)和人肾透明细胞癌皮肤转移细胞(Caki-1)中，AKT和S6K1的磷酸化水平显著上调，从而使基质金属蛋白酶2(matrix metalloprotein-2，MMP-2)和MMP-9表达上调，细胞迁移能力增强[21].(4)影响Rho GTPases的表达和激活：雷帕霉素处理后，人宫颈癌细胞(HeLa细胞)的迁移能力减弱，在该细胞中过表达RhoA蛋白后，受损的细胞迁移能力得到提高，恢复到与野生型相当的水平，而该过程中Rho GTPases的表达受到S6K1调控[22].

2.1.2 mTORC1通过调控4E-BP1调节细胞迁移

4E-BP1是一种翻译抑制因子，与真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E，eIF-4E)之间的结合受磷酸化调控.eIF-4E是一种帽结合蛋白，在真核生物翻译起始阶段，通过与真核起始因子4G(eukaryotic initiation factor 4G，eIF-4G)和真核起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4A，eIF-4A)结合形成三聚体的真核起始因子4F(eukaryotic initiation factor 4F，eIF-4F)，辅助含有5′-非翻译区的mRNA与核糖体结合，启动MMP-9的mRNA翻译，增强细胞运动能力[7,23].活化的mTOR直接在T37/T46位点磷酸化4E-BP1使其失活，从而促进蛋白质翻译起始复合物的形成，调节细胞生长和迁移能力[6,23-24].mTORC1通过调控4E-BP1的磷酸化从而调节细胞迁移的具体机制在肿瘤细胞侵袭转移能力的研究中有较好的揭示：蜗牛同源物1蛋白(Snail1)抑制E-钙粘蛋白表达，从而增强上皮间充质细胞转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，而EMT是实体肿瘤发生转移的重要过程[25-26].4E-BP1的磷酸化能激活翻译过程，选择性地上调Snail1的表达来增强EMT功能，增强细胞迁移、侵袭和转移能力[27].此外，转移相关蛋白1(metastasis associated protein-1，Mta-1)可能通过AKT/mTOR/4E-BP1通路促进子宫内膜癌进展[28].在珠蛋白基因过度表达的小鼠成纤维细胞中，mTOR、S6K1和4E-BP1的磷酸化水平下降，细胞迁移能力受损[17].

2.2 mTORC2对细胞迁移的影响

2.2.1 mTORC2通过直接调控肌动蛋白细胞骨架调节细胞迁移

肌动蛋白细胞骨架的动态组装是细胞迁移的基础，mTORC2可以直接调控肌动蛋白细胞骨架来调节细胞迁移.在中性粒细胞趋化运动过程中，mTORC2可直接调控F-actin极化和肌球蛋白II(myosin II，MyoII)磷酸化[22].在HeLa细胞中，mTORC2直接在丝氨酸2 152位点磷酸化细丝蛋白A，影响黏着斑的形成[29].mTORC1/mTORC2的双抑制剂KU0063794能特异地引起F-actin的异常积累和微管的无序分布，影响内皮细胞的伸长和成管[30].研究发现，在胶质母细胞瘤细胞(GL15细胞)中，抑制mTORC1后，肌动蛋白应力纤维的数量减少，细胞迁移速度减缓，而抑制mTORC2后，肌动蛋白应力纤维的形成完全被破坏，细胞迁移被抑制[31].

2.2.2 mTORC2通过调控AKT调节细胞迁移

AKT是一种Ser/Thr激酶，由三种亚型(AKT1、AKT2和AKT3)组成，细胞的存活、代谢、增殖和肌动蛋白细胞骨架组织都依赖于AKT的激活[32-33].mTORC2的关键组分Rictor通过调控AKT在调节细胞的趋向运动中发挥关键作用：(1)对高等真菌盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)研究表明，Rictor的同源异构体PiaA是细胞趋电性相关的重要基因[34].(2)抑制白细胞中的Rictor基因后，细胞趋化性明显减弱[22].在本课题组进一步的细胞趋电性实验中发现，Rictor表达降低并不影响细胞对电场方向的响应及在电场下的趋电性迁移速度，这与在盘基网柄菌中的结果完全不同.

mTORC2通过调控AKT进而调控细胞迁移的机制主要包括：(1)调节肌动蛋白组装：mTORC2/AKT可以在肌动蛋白结合蛋白(Girdin)的1 416位点磷酸化丝氨酸使其激活，而后在正在迁移的细胞前缘聚集磷酸化的Girdin，从而介导细胞迁移[35].经抑制剂PP242处理后，mTORC2/AKT被抑制，导致多形胶质母细胞瘤细胞前缘的肌动蛋白应力纤维解体，F-actin的积累受损，从而抑制细胞的迁移和侵袭能力[31].此外，PDK1/AKT通过调节辅助蛋白(如肌动蛋白亚基p150)的结合来控制微管，从而控制小鼠新皮层神经元通过皮层板的迁移速度，而mTORC2在此过程中的调控作用还有待进一步研究[36-37].(2)影响EMT进程：mTORC2下调后造成的AKT1下调能促进乳腺上皮细胞的EMT进展[38].顺铂和阿司匹林联合使用能抑制非小细胞肺癌球状体的迁移，对其潜在机制的研究发现，阿司匹林预处理可抑制mTOR的基因转录，进而导致AKT未被磷酸化，从而激活糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase，Gsk3β)，使得Snail和β连环蛋白不稳定，恢复EMT过程[39].(3)促进活化T细胞的核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)泛素化和降解：mTORC2激活AKT后，AKT通过蛋白酶体促进NFAT的泛素化和降解，从而损伤细胞的迁移和侵袭能力[40].(4)与mTORC1相似，mTORC2/AKT也能调控基质金属蛋白酶家族中的MMP-2和MMP-9的表达来抑制细胞迁移和侵袭[41].

2.2.3 mTORC2通过调控PKC家族成员调节细胞迁移

PKC是一种丝/苏氨酸激酶，与蛋白激酶A和蛋白激酶G共同组成AGC家族.在哺乳动物细胞中，mTORC2通过磷酸化不同的PKC家族成员，调节肌动蛋白重组进而参与肿瘤发生和细胞运动[13,42].Masri等人的研究证实，Rictor和PKC-α的过表达会增强神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力[43].在口腔鳞状细胞癌细胞中，使用星孢菌素抑制PKC后，细胞中P120连环蛋白和E-钙粘蛋白的表达增加，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力明显降低[44].mTOR抑制剂处理胶质母细胞瘤细胞后，PKC-α活性降低，随后导致MMP-2和MMP-9的活性增强，细胞迁移能力增强[45].

3 小结和展望

细胞迁移是一个高度协调的多步骤重叠发生的复杂过程，很多信号通路参与细胞迁移的调节过程.mTOR是细胞生长、增殖、分化和存活的中枢调控因子，其参与形成的多蛋白复合物mTORC1和mTORC2通过调控多个下游分子调节细胞运动、侵袭和恶性肿瘤转移(图2).mTORC1磷酸化S6K1和4E-BP1，调控细胞生长、增殖、迁移和侵袭.mTORC2调控下游AGC激酶家族的AKT和PKC从而调节肌动蛋白细胞骨架的组装，进而影响细胞迁移能力.然而仍有问题尚不清楚，例如：(1)尽管诸多研究结果都证明AKT参与调控细胞迁移，但是AKT调控细胞迁移的具体效应器还不清楚；(2)mTOR下游的另一个效应分子SGK是否参与细胞运动和侵袭的调控，如果参与，又是如何调控的；(3)在调控细胞迁移过程中，mTOR与其他信号通路或蛋白质相互作用的具体机制也不清楚；(4)mTOR复合物的各个组分在细胞迁移过程中的贡献如何.细胞迁移在个体发育、血管生成及肿瘤转移等重要生理或病理过程中具有重要的作用，全面理解mTOR信号通路在细胞迁移中的具体调控机制有助于对诸多生物学过程的理解，也有助于相关疾病的诊疗，如根据相关机理开发新的靶向药物，提供新的治疗策略.