环状RNA Hsa_circ_0102434在胃癌中的表达及其临床价值研究

张晨静 王婧雅 耿晓歌 潘文胜

全球范围内，胃癌（GC）发病率和病死率分别位列恶性肿瘤的第2位和第3位。我国胃癌每年新发病例为67.91万，死亡病例为49.8万，发病人数和死亡人数均高居恶性肿瘤第2位，且呈现上升趋势［1］。研究表明ncRNA在肿瘤的发生发展中发挥重要作用［2］。环状RNA（circular RNA，circRNA）是由反向剪接反应（back-splicing）的特殊剪接机制形成的、具有闭合环状结构、大量存在于真核转录组中的一类特殊的非编码RNA［3］。相较于线性非编码RNA，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定。有研究表明 circRNA 可以在转录以及转录后等多个层面上调节基因的表达，对机体的多种生理及病理过程起着重要的调控作用［3］。本文探讨环状RNA Hsa_circ_0102434在胃癌中的表达及其临床价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2015年5月至2018年7月浙江大学第二附属医院和浙江省人民医院的原发性胃癌患者，选择术前未行放疗及化疗的患者46例。采集所有患者术中肿瘤组织和距离肿瘤>5cm的正常癌旁组织。手术切除后，收集组织样品并在液氮中冷冻，然后再检测。本研究经杭州医学院伦理委员会批准（2018KT085）。

1.2 方法 （1）RNA提取和纯化：通过TRIzol（美国Invitrogen公司）提取每个样品的总RNA，使用Agilent 2100生物分析仪检查RNA的浓度、纯度和完整性。然后，使用SuperScriptTM IV合成系统（美国，Invitrogen）将RNA纯化并逆转录为cDNA。（2）荧光定量PCR：采用TB GreenTM Premix DimerEraserTM（完美实时）在ABI 7900 Real-Time PCR System（美国Thermo Fisher Scientific）上通过qRT-PCR扩增。以GAPDH为内参，校正每个样本的Ct，计算△Ct值，以2-△△Ct计算基因表达。将PCR产物送广州吉赛生物公司科技有限公司进行测序，以确保环状RNA检测的准确性。见表1。

表1 用于qRT-PCR检测的引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0及GraphPad Prism 5.0软件统计。计量资料比较采用t检验。Hsa_circ_0102434的表达水平与患者临床病理指标间的关系用单因素方差分析（ANOVA）。利用ROC曲线分析环状RNA在组织中的表达差异作为胃癌诊断指标的可能性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 环状RNA Hsa_circ_0102434在胃癌组织中表达 与癌旁组织相比，Hsa_circ_0102434在胃癌组织中的表达明显上调（P=0.0002）。见图1。将PCR产物送吉赛公司测序，结果确认该序列为带有反向剪接位点的Hsa_circ_0102434。见图2。

图1 Hsa_circ_0102434在胃癌组织及癌旁组织中表达水平

图2 剪切位点测序图

2.2 胃癌组织中环状RNA Hsa_circ_0102434表达量与临床病理特征的相关性 将胃癌组织中环状RNA Hsa_circ_0102434的表达量取中位数分为低表达组与高表达组，进一步分析患者Hsa_circ_0102434表达水平与其临床病理指标的相关性。结果显示，Hsa_circ_0102434高表达与远处转移相关（P<0.05），与性别、年龄、肿瘤大小、病理分期、肿瘤分化程度、血管浸润及淋巴结转移无关（见表2）。

表2 环状RNA Hsa_circ_0102434的表达水平与胃癌临床病理指标间的关系

2.3 环状RNA Hsa_circ_0102434可作为胃癌的诊断标志物 为了进一步研究RNA Hsa_circ_0102434对胃癌的诊断价值，以Hsa_circ_0102434在组织中的表达作为指标绘制ROC曲线（见图3），结果显示曲线下面积 0.743（95%CI 0.642～0.844，P<0.0001），敏感度和特异度分别是78.3%和60.9%，诊断临界值是1.605，约登指数为0.392。

图3 Hsa_circ_0102434的ROC曲线

3 讨论

环状RNA曾经被认为是由低丰度和技术局限性引起的剪接错误的副产物，而近年来，随着RNA-seq和生物信息学分析的发展，环状RNA受到广泛关注。与线性RNA不同，cir-cRNA通过外显子环化或内含子环化将3'和5'末端连接在一起形成共价闭环结构。环状RNA在生物中丰富，多样且稳定。较多研究人员发现环状RNA在调控中起重要作用［1-3］。最近研究也发现环状RNA参与肿瘤的发生发展，但其作用机制尚不清楚。

一些研究发现circRNA可作为微小RNA海绵（miRNA sponge）发挥作用［4］，例如，在肝癌中CDR1as高表达，能够通过抑制miRNA-7发挥促癌作用［5］；又如，circHIPK3通过抑制miRNA-124调控肿瘤生长［6］。全基因组研究表明miRNA海绵机制并非普遍适用［3，7］，其它一些机制也相继被提出。最近研究发现，在某些特殊情况下，环状RNA脱离其非编码RNA的属性（不能编码蛋白质），可作为蛋白质合成过程中的翻译模板，指导功能蛋白的合成［8］。如环状RNA来源的蛋白质/多肽在肌形成以及细胞应激过程中发挥重要的生物学功能［9-10］；环状RNA SHPRH能够通过合成一种新型蛋白参与胶质瘤的发生发展［11］。越来越多研究表明，环状RNA在肿瘤的发生和肿瘤的发展中起着重要的作用。如，Hsa_circ_0001649在肝细胞癌中表达下调［12］；Hsa_circ_100855和Hsa_circ_104912在喉鳞状细胞癌（LSCC）组织中表达失调［13］；胃癌Hsa_circ_002059表达的降低与远端转移，TNM分期，性别和年龄显著相关［14］。作者前期应用高通量测序对胃癌组织及癌旁组织分析发现Hsa_circ_0102434在胃癌组织及癌旁组织中差异表达，进一步qRT-PCR研究结果显示Hsa_circ_0102434在胃癌组织中的表达明显上调；进一步研究发现，Hsa_circ_0102434的表达与胃癌的远处转移相关，远处转移是评估肿瘤的关键因素，提示Hsa_circ_0102434可能与胃癌的进展关系密切。本资料显示，Hsa_circ_0102434对胃癌的诊断结果显示曲线下面积 0.743（95%CI 0.642～0.844，P<0.0001），具有较高的诊断效能，以1.605为诊断临界值，敏感度和特异度分别为78.3%和60.9%，提示将胃镜常规活检组织行Hsa_circ_0102434检测作为潜在胃癌诊断方法，为开发新型胃癌诊断标志物提供基础。

综上所述，Hsa_circ_0102434在胃癌组织中表达升高，与胃癌进展关系密切，同时对胃癌具有一定的诊断价值，是筛查胃癌的潜在生物标志物。