GSK-3β表达水平与胶质瘤患者预后的关系

赵凯 王志武 杨俊泉

[摘要] 目的 分析糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表达水平与胶质瘤患者预后的关系。 方法 收集2010年1月～2014年12月河北省唐山市人民医院接收手术治疗胶质瘤148患者的组织标本和临床病理资料。根据GSK-3β表达水平将其分为GSK-3β高表达组（85例）和GSK-3β低表达组（63例）。收集两组年龄、性别、肿瘤长径（<4 cm，≥4 cm），肿瘤位置（额叶、颞叶、其他），WHO分级资料，免疫组化检测GSK-3β在组织中的表达，Kaplan-Meier分析和Cox回归分析GSK-3β表达与胶质瘤患者的预后关系。 结果 GSK-3β表达水平与WHO分级明显相关（P < 0.05）。GSK-3β高表达组的总生存时间短于GSK-3β低表达组（HR=2.31，95%CI：1.87～4.15，P < 0.01）。GSK-3β高表达、WHO高分级是预后不良的影响因素。结论 GSK-3β高表达与胶质瘤患者的不良预后有关，是其不良预后的独立预测因子。

[关键词] 胶质瘤;糖原合成酶激酶-3β;预后;免疫组化

[中图分类号] R739.4          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（b）-0113-04

Relationship between GSK-3β and prognosis in patients with glioma

ZHAO Kai   WANG Zhiwu   YANG Junquan

The First Department of Chemoradiotherapy， Tangshan People′s Hospital， Hebei Province， Tangshan   063000， China

[Abstract] Objective To analyze the relationship between glycogen synthase kinase-3β （GSK-3β） expression and prognosis of glioma patients. Methods Tissue specimens and clinical pathological data of 148 cases who received surgical treatment for glioma in Tangshan People′s Hospital of Hebei Province from January 2010 to December 2014 were collected. According to the expression of GSK-3β， they were devided into GSK-3β high-expression group （85 cases） and GSK-3β low-expression group （63 cases）. Age， gender， tumor length and diameter （<4 cm， ≥4 cm）， tumor location （frontal lobe， temporal lobe， others）， WHO grading data of two groups were collected. Immunohistochemical analysis of GSK-3β expression in tissues， Kaplan-Meier analysis and Cox regression analysis of the relationship between GSK-3β expression and the prognosis of glioma patients. Results GSK-3β expression level was significantly correlated with WHO grade （P < 0.05）. The total survival time of GSK-3β high-expression group was shorter than that of GSK-3β low-expression group （HR=2.31， 95%CI： 1.87-4.15， P < 0.01）. High GSK-3β expression and WHO grade were the factors affecting poor prognosis. Conclusion The high expression of GSK-3β is related to the poor prognosis of glioma patients， and it is an independent predictor of poor prognosis.

[Key words] Glioma; Glycogen synthetase kinase-3β; Prognosis; Immunohistochemistry

胶质瘤是成人原发性脑肿瘤中最具侵袭性的类型，包括星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突-星形膠质瘤细胞和室管膜瘤[1]。胶质瘤又可分为WHO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级，级别越高，恶性程度越高;对于WHO Ⅳ级胶质瘤患者，中位生存时间只有12～15个月，对于Ⅲ级和低级别（Ⅰ和Ⅱ级）胶质瘤患者，生存期虽然可超过两年，但因为其具有高度侵袭性和对治疗的抵抗，预后也不尽如意[2-3]。尽管临床实践中已经运用多种策略，包括通过预测工具、分子和遗传信息来辅助胶质瘤的诊治管理，但肿瘤进展和复发风险仍然是一个重要问题。近5年来，胶质瘤的治疗方法有所改进，但患者的中位生存率并不令人满意。因此，有必要探索新的癌症相关基因，来作为胶质瘤治疗预后标志物[4]。

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是一种多功能的Ser/Thr激酶，包括α和β两种亚型，最初被认为是糖原代谢和胰岛素信号转导的关键介质[5]。GSK-3β是其亚型之一，在多种信号通路起核心作用，如Wnt/β-catenin和Akt等[6-7]。GSK-3β的失调也与肿瘤发生和发展有关，如前列腺癌、胃癌和食管癌等[8]。Zhao等[9]研究发现，GSK-3β可以调节mTOR/p70S6K1信号通路，抑制神经胶质瘤的进展。然而，GSK-3β的表达情况在神经胶质瘤中临床意义尚不明确。本研究分析了GSK-3β表达与胶质瘤预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年1月～2014年12月河北省唐山市人民医院（以下简称“我院”）接收手术治疗的脑胶质瘤患者。纳入标准：①术后病理证实为脑胶质瘤，②病历资料且随访信息完整;③患者了解本研究并签署知情同意书。排除标准：①患有高血压、糖尿病、冠心病等慢性疾病，肺炎、肝炎和肺结核等急慢性感染者;②术前接受过放化疗或患有其他恶性肿瘤者。本研究共纳入研究对象148例，平均年龄（56.0±9.8）岁，其中男67例，女81例。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

本研究所用标本均来自我院脑外科术后的组织标本。因研究为回顾性研究，实验开始时所有患者均已完成病理相关诊断，术后组织标本均已包埋于石蜡中储存。免疫组织化学检测，神经胶质组织包埋在石蜡中，然后在4 μm切片机上进行切片。切片放置在载玻片上，在不同的时间段里使用不同浓度的酒精溶液（75%、80%、90%、95%、100%）脱水，使用二甲苯进行清洗。本研究采用两步间接免疫组化染色法。将针对人GSK-3β的兔抗体（Solarbio公司，货号：K000492P，生产批号：20180804）分别稀释至1∶200和1∶250。抗体染色后，4℃过夜。采用过氧化物酶偶联二抗与3，3′-二氨基苯并苯胺（DAB）底物-染色原反应，用于福尔马林固定石蜡包埋组织切片。在切片上与DAB反应可在抗原部位产生不溶于乙醇和二甲苯的棕色产物。切片用磷酸缓冲盐溶液（北京中杉金桥公司，货号：ZLI-9062，生产批号：20190102）冲洗3次，然后应用光学显微镜以200倍的放大率观察组织中靶蛋白的表达。随机选择5个高倍视野，计数500个细胞，并计算免疫组化的细胞占总细胞数的百分比，百分比≥50%为高表达，<50%为低表达，根据GSK-3β表达水平将其分为GSK-3β高表达组和GSK-3β低表达组。

1.3 观察指标

收集受试者年龄、性别、肿瘤长径（<4 cm，≥4 cm），腫瘤位置（额叶、颞叶、其他），WHO分级（Ⅰ/Ⅱ，Ⅲ/Ⅳ），其中肿瘤长径、位置、WHO分级分组统计的分组方法参考经典文献[9-10];观察GSK-3β表达水平与预后的关系。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;计数资料用百分率表示，组间比较采用χ2检验;采用多因素Kaplan-Meier和cox回归进行相关性分析，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脑胶质瘤患者一般资料及临床病理参数与GSK-3β表达水平的关系

两组年龄、性别、肿瘤长径、肿瘤位置比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。两组卡氏功能状态评分（KPS）比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;GSK-3β表达水平与肿瘤WHO分级有关（P < 0.05）。

2.2 GSK-3β表达与胶质瘤患者预后的关系

GSK-3β高表达组的总生存时间短于GSK-3β低表达组（HR=2.31，95%CI：1.87～4.15，P < 0.01）;Ⅲ/Ⅳ级预后比Ⅰ/Ⅱ级更差（HR=1.34，95%CI：1.21～2.69，P < 0.05）。多因素Cox回归分析提示，GSK-3β高表达、WHO高分级是预后不良的影响因素。见图1、表2。

3 讨论

近年来尽管在手术、放疗和化疗方面取得了进展，但胶质瘤患者的预后仍然较差。胶质瘤患者尤其是胶质母细胞瘤患者的1、3、5年相对生存率分别低于30%、5%、3%[14]。因此，寻找并确认胶质瘤的预后因子对提高胶质瘤患者的预后和治疗至关重要。分子水平的标志物在多种不同癌症类型的检测和治疗中发挥重要作用，包括各种脑部疾病[11]。Cheng等[12]结果显示，PAX6作为miR-335的新靶点，在胶质瘤中具有抗癌作用，推测PAX6可能作为治疗胶质瘤的靶点。本研究尝试探讨GSK-3β在判断脑胶质瘤中的预后作用。

局部浸润性生长和血管生成是胶质瘤的主要特征，因此，肿瘤增殖、侵袭、及血管生成的分子标志物均有可能是胶质瘤的预后因子。GSK-3β最初被认为是糖原合成酶激酶的限速酶，之后研究提示GSK-3β除在糖代谢中起作用外，其生物学作用尚与肿瘤的増殖、侵袭、调亡及血管生成等过程密切相关[8]。最近的研究[13]显示，GSK-3β是一个肿瘤抑制组分的相关分子之一，因为其在肿瘤中可以直接磷酸化β-catenin蛋白，执行靶向降解。研究显示，GSK-3β在多种人类癌症中存在特异性表达[14]，如Wang等[15]认为SOX9 mRNA的过表达与恶性胶质瘤患者临床预后不良密切相关，靶向SOX9可能是一种新的治疗策略。GSK-3β在胶质瘤中的作用有较多的基础研究[16]，Miyashita等[17]比较了23例胶质瘤组织和癌旁组织样本中的GSK-3β表达水平的差异，发现肿瘤组织较周围正常组织的GSK-3β表达水平更高而靶向GSK-3β的特异性小分子抑制剂可减弱胶质瘤细胞的増殖能力，促进其凋亡。Zhao等[9]在体外研究中分别应用GSK-3β抑制剂或RNAi干扰技术抑制GSK-3β的表达，胶质瘤细胞的增殖和侵袭增强，同时其凋亡率减低。Yang等[18]揭示GSK-3β是通过磷酸化53BP1诱导胶质母细胞瘤细胞核中的DNA DSB修复，有可能是增强放疗敏感性的治疗靶点。Zhou等[19]研究发现，GSK-3β促进组蛋白脱甲基酶KDM1A的累积，并在肿瘤发生过程中调节组蛋白H3K4甲基化，导致癌症干细胞自我更新和胶质母细胞瘤的发生。此外，GSK3抑制剂Tideglusib使小鼠移植瘤对化疗敏感性增强，并提高其生存率[7，19-20]。

然而，GSK-3β在神經胶质瘤患者的临床作用尚不清楚。在目前的研究中，本研究调查了GSK-3β表达与没有接受放化疗的胶质瘤患者预后的关系，发现GSK-3β高表达与胶质瘤患者的不良预后有关。GSK-3β的表达明显受到WHO分级的影响，GSK-3β可能参与神经胶质瘤的发生和发展。Kaplan-Meier生存分析显示，GSK-3β高表达组的总生存时间短于GSK-3β低表达组（P < 0.05），提示GSK-3β表达对神经胶质瘤患者的预后相关。多因素生存分析进一步证实GSK-3β高表达与不良预后的关系，提示GSK-3β高表达可能是一个独立的预后指标。

本研究尚存在一些局限性，首先本研究为回顾性研究，不可避免的会出现相关的研究偏倚，该结果尚需前瞻性研究来进一步证实。另外本研究为单中心的研究，样本量有限，这需要多中心的研究来进行下一步的确证性研究。

总之，本研究发现GSK-3β高表达与胶质瘤患者的不良预后有关，是其不良预后的独立预测因子，将来应该进一步研究其分子机制，开发以其为靶点的靶向药物。

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（收稿日期：2019-12-06  本文編辑：刘明玉）