酥梨铁头病果实与正常果实果肉组织活性比较

刘肖烽 李舒然 李六林

（山西农业大学园艺学院，晋中030800）

酥梨（Pyrus bretschneideri cv.Suli）是我国种植的主要果树树种之一，历史悠久[1-2]。近几年，部分酥梨果实上发现果顶部位硬度极大且回缩明显，生产上称之为“铁头病”，病果失去商品价值[3]。目前关于铁头病的研究集中于发病原因，其发生可能与树体本身以及果园管理[4]、水分胁迫[5]、叶片和果实水分利用率有关[6]，且有研究认为果实膨大期为发病关键时期[7]。Wang等[8]进一步研究认为铁头病是由于果实缺钙引起。组织结构观察发现，发病果实石细胞团直径变大[9-11]。但未发现有对病果果顶部位回缩以及铁头病影响下果肉组织细胞活性状况的研究。

本研究利用中性红、伊文斯蓝、红墨水、FDA对病果细胞活性进行鉴定，旨在探明铁头病对果肉组织活性的影响，为铁头病的研究提供参考依据。细胞结构完整的植物组织，活性越强，中性红染色程度越强[12]，FDA在细胞内形成绿色荧光强度越强[13]，而不会被伊文斯蓝[14]和红墨水[15]染色。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验地点位于山西省祁县修善村，在村中选取正常果园与发病果园。两个果园常规管理，树龄为10年生以上。正常果园没有铁头病发生，发病果园均为连续3年发病，且发病率最高达40%。

1.2 试验方法

1.2.1 伊文斯蓝染色 参照史华平[14]等的方法略有改进。用水果刀垂直于酥梨果实赤道面纵切，取果实中部约1 mm厚果片。浸泡于0.4 mol/L甘露醇中，之后立即放入浓度为0.025%的伊文斯蓝染液中浸染7 min，取出洗净后放入缓冲液中洗脱，拍照并计算颜色值。

1.2.2 红墨水染色 材料处理方法同1.2.1，将果片放入浓度为5%的红墨水[16]中染7 min，洗净、洗脱后拍照并计算颜色值。

1.2.3 中性红染色 材料处理方法同1.2.1，将果实放入浓度为0.005%的中性红[12]溶液中浸染7 min，取出洗净后进行洗脱，拍照并计算颜色值。

1.2.4 FDA染色 参照黄译瑾[17]等的方法略有改进。分别于正常果实果肩、果顶部位和病果果肩、果顶部位进行徒手切片，放置于浓度为0.01%FDA溶液中，25℃黑暗环境下放置7 min，之后用荧光显微镜（Nikon Ni-U、Nikon C-HGFI荧光发射源、Nikon-Fi3相机）观察染色结果，蓝光激发，目镜为10×，物镜为4×。选取5个区域计算荧光强度。

1.3 数据分析

用ImagePro Plus计算中性红、伊文斯蓝、红墨水染色颜色值与FDA的荧光强度。用Origin 2018和Office Excel 2010进行柱形图制作。用SAS8e进行试验数据显著性分析。

2 结果与分析

2.1 中性红、伊文斯蓝和红墨水检测铁头病果实与正常果实活性

图1 正常果实、铁头病果实和煮沸的正常果实染色

中性红对正常果实和铁头病果实染色深（图1 A-B），颜色值分别为 1 214.807和 1 210.139，无显著差异(图2)，但是显著高于对煮沸后果实染色的颜色值13.121（图1C和图2）。

伊文斯蓝与红墨水对正常果实与铁头病果实染色均较浅，主要是果肉表层部分组织被染色（图1 D-E），而对经煮沸后的果实染色极深（图1 F）。正常果实与铁头病果实被伊文斯蓝与红墨水染色后颜色值均无显著差异，但是均显著低于被对应染液染过的煮沸后果实的颜色值（图 2）。

图2 正常果实、铁头病果实和煮沸的正常果实整体染色分析

2.2 FDA检测铁头病果实与正常果实果肩与果顶部位组织活性

正常果实果顶部位荧光分布均匀(图3 a-a1)，铁头病果实果顶部位荧光分布密集，细胞集中分布(图3 c-c1)。正常果肩与铁头病果肩部位荧光分布状况相似(图3 b-b1和图3 d-d1)，正常果实果肩与果顶、铁头病果实果肩与果顶荧光强度分别为 59.930、58.394、58.682 和 60.272，无显著差异(图4)。

图3 正常果实与铁头病果实各部位FDA荧光

图4 正常果实与铁头病果实FDA染色分析

3 讨论与结论

红墨水与伊文斯蓝对正常果实与铁头病果实染色结果显示，正常果实与铁头病果实被染色程度基本相同，没有显著差异。为保证结果的准确与直观，对煮沸过的正常果实也进行相应染色，颜色值显著低于正常果实与铁头病果实被染色对应的颜色值。就果肉细胞活性而言，铁头病果实与正常果实无显著差异。铁头病并未对果实细胞活性造成显著影响，未导致果肉细胞死亡。在染色过程中病果组织与正常果组织表面均被染色是由于在制作切片过程中表层果肉细胞受到损伤。伊文斯蓝染色尤为明显，是由于除机械损伤外，伊文斯蓝有其本身的颜色残留，而这部分颜色残留并不是由于细胞死亡造成的，因此在对组织染色时，红墨水染色比伊文斯蓝染色更加准确。

中性红对正常果实与铁头病果实染色颜色值无显著差异，为保证结果的准确与直观，对煮沸过的正常果实也进行染色，颜色值显著低于正常果实与铁头病果实颜色值。表明铁头病没有造成果实组织坏死。在FDA染色中，正常果实与铁头病果实各部位荧光强度均无显著差异，铁头病并没有影响果实的细胞活性。铁头病果实果顶部位细胞排列紧密，这可能是铁头病果实果顶部位硬度大的原因之一。

综上所述，铁头病对果实各部位果肉组织活性无显著影响，病果果顶回缩的现象不是果顶部位细胞死亡造成的。