中蜂和意蜂对巨桉叶片挥发物的EAG和行为反应

熊朝勇张如义林雄

(1.内江职业技术学院，四川内江 641000；2.四川省内江市农业科学院，四川内江 641000)

自然界中植物挥发性次生物质所产生的特异性气味是专一性的特殊标记，容易被特定昆虫识别，昆虫可通过它来寻找到食物源[1]。植物挥发性次生物质一方面可以吸引传粉者，另一方面是植物本身释放防御物质，可以起到排斥一些非寄主性昆虫的作用[2]。昆虫是通过自身触角上的化感器来感受植物挥发性次生物质，触角电位技术(electroantennogram，简称EAG)是鉴别植物挥发性次生物质对昆虫有无影响的常规技术之一，测定的是昆虫触角全部化感器对刺激物电生理反应的总和[3]。

蜜蜂是自然界中显花植物的主要授粉昆虫之一，而采集行为则是蜜蜂生存的重要条件，其灵敏的嗅觉可以有效识别分辨蜜源的信息，而且不同种蜜蜂的采集习性也存在较大的差异性[4-5]。例如，中华蜜蜂Apis cerana cerana和意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(以下分别简称为中蜂和意蜂)是我国普遍饲养蜜蜂的主要亚种[6]。中华蜜蜂又被称为中蜂、土蜂，是我国独有的本土优良蜜蜂，通常生活在以杂木林为主的森林群落和传统的农业群落中[7]。从1896年开始，我国引进以意蜂为主的西方优良蜜蜂[8]，目前，意蜂已广泛分布于全国(西藏自治区除外)，其密度在大多数地区超过原有中蜂，导致我国中蜂分布区域急剧减少[9]。意蜂在自然界中一般善于利用较大规模的蜜源，中蜂更能有效利用一些零星蜜源，但意蜂采集植物的种类范围小于中蜂[10-11]。

巨桉Eucalyptus grandis作为桃金娘科Myrtaceae桉属Eucalyptus常绿高大乔木，原产澳大利亚东部沿海地区，因其适应性广、萌芽力强、喜光耐旱、抗逆性好、繁殖容易、病虫害少而被巴西、加拿大、中国等国家引种营造商品林、用材林、经济林等[12]。大量研究表明桉属许多树种的枝叶、枯落物及其林下表土的水溶性挥发物质能抑制其它动物、植物以及微生物的正常生长[13]，进而影响人工混交林的生态系统营造[14]。如柠檬桉Eucalyptus citriodora叶中

挥发性化感物质能抑制萝卜、玉米等农作物种子萌发[15]；巨桉凋落叶分解初期释放的化感物质能损害受体植物小白菜的光反应系统进而抑制小白菜的生长[16]。在我国广东、海南、广西、福建、四川和江西等南方地区，巨桉已作为重要的人工用材林树种和优良的蜜源植物大面积推广种植，但带来巨大经济效益的同时，也反应出系列生态环境问题(水分、养分、生物多样性等)[17]，逐渐成为我国林业以及环境保护等科研人员关注的焦点。笔者通过研究中华蜜蜂和意大利蜜蜂对巨桉鲜叶和凋落叶挥发性提取物的EAG和嗅觉行为反应，探索巨桉挥发物对传粉昆虫的访花行为是否有趋避作用，以利于深入了解巨桉对蜜蜂的行为影响，为巨桉人工林可持续发展和生态多样性保护提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 供试蜜蜂 试验用中蜂和意蜂来自四川省内江市农业科学院中蜂和意蜂养殖场(N 29°37′，E 105°1′)，平均海拔320 m。室内试验均在内江市农业科学院生物实验室进行；中蜂和意蜂分别放入20 cm×20 cm×20 cm的纱网中，在室内自然条件下饥饿处理24 h，待其状态稳定后备用。

1.2 挥发性提取物 巨桉叶片样品采自四川省内江市东兴区、市中区标准地的10 a生巨桉林。参照杨桦等[18]的研究方法，用采样袋分别采集巨桉凋落叶和新鲜叶各 12，24，36，48 g；用大气采样器以0.5 L/min的空气流速，动态吸附采集1 h，然后用5 mL正己烷洗脱，氮气吹浓缩至2 mL，即为不同质量叶片的挥发性提取物样品。

1.3 中蜂和意蜂触角电位反应测定 用触角电位仪(荷兰Syntech公司生产，并提供测定所用相关软件)测定中蜂和意蜂对巨桉叶片挥发物的触角电位反应。测试时用锋利刀片切下中蜂和意蜂触角，用SpectraR 360导电胶将触角固定在PR(Gain10×)电极上，气味管与触角相距1 cm，剂量反应测试时取10 μL提取物样品，均匀滴在折成“V”字型的滤纸条(2 cm×0.5 cm)上，放入10 cm长的样品管中，样品管末端连接气体刺激控制装置[19]；先用正己烷测试，测试时巨桉凋落叶和新鲜叶挥发物样品的检测次序是随机的，同类叶片样品按挥发物含量自低向高进行检测，待基线稳定后给予刺激，刺激时间为0.5 s，两次刺激间隔为60 s，以保证触角感受能够完全恢复，每处理测试中蜂、意蜂触角各6根，每样品平均刺激5次，两次刺激的中间需用净化空气吹2 min，以减少气味分子在触角附近堆积，防止适应现象发生[19]；以正己烷作为对照，将每一样品观测值的平均值除以前后2次对照测定的平均值即得EAG反应相对值[19]。

1.4 嗅觉行为反应的测定 中蜂和意蜂对巨桉叶片挥发物的嗅觉趋向行为测定参照王红伟等[19]方法。“Y”型嗅觉仪由主臂长 6.0 cm、侧臂长6.0 cm、侧臂夹角45°、内径0.5 cm的透明玻璃制成，在侧臂距基部10 cm处伸出2个样品室；嗅觉仪主臂与大气采样仪(QC-1B型)连接，侧臂分别通过硅胶管与样品室相连接[19]；在气流进入样品室之前，先经过一个活性炭过滤器和装有蒸馏水的特氏多孔滤瓶，主臂空气流速调节为0.5 L/min左右，以净化空气和增加空气湿度[19]。测定时，以4 cm2滤纸作气味源载体，每次吸取10 μL的挥发物样品溶液在滤纸上作为气味源，以正己烷作对照[19]，从“Y”型嗅觉仪主臂管口引入待测中蜂和意蜂，中蜂和意蜂在“Y”型管分叉处做出选择，趋向不同的侧臂，每只观察3 min，爬过侧臂1/3且停留30 s以上记为对该挥发性气味物质有选择，反之记为对该气味无选择[19]，试验重复3次，每次测试中蜂、意蜂各30只，每测5只调换1次“Y”型管两臂的位置，每次重复后更换滤纸条，并用无水乙醇擦洗管的内、外壁，烘干后再测，以消除管臂位置和挥发物质残留对中蜂和意蜂行为可能产生的影响[19]。

1.5 数据统计与分析 采用SPSS 15.0软件对试验数据进行统计分析，采用Excel 2003绘图，利用配对T检验比较中蜂、意蜂之间对不同处理巨桉叶片挥发物的EAG反应及行为反应差异；采用χ2法检验行为生测数据的单选试验差异性，计算引诱率、驱避率及反应率。

引诱率(%)＝处理壁内总蜂数/测试总蜂数×100；驱避率(%)＝对照壁内总蜂数/测试总蜂数×100；反应率(%)＝(对照壁内总蜂数＋处理壁内总蜂数)/测试总蜂数×100

2 结果与分析

2.1 中蜂和意蜂对巨桉叶片挥发物的EAG反应

2.1.1 中蜂和意蜂对不同质量叶片提取的挥发物EAG 反应 不同质量(12，24，36，48 g)鲜叶、凋落叶提取的挥发物均能引起中蜂和意蜂触角的EAG反应，且中蜂和意蜂对不同含量提取物的EAG反应显著差异(P＜0.05)(图1)。随着凋落叶和鲜叶质量的增加，中蜂和意蜂触角对其挥发性提取物的EAG反应强度呈增加趋势；鲜叶质量为36 g时，中蜂和意蜂对其提取的挥发物的EAG反应值达到最高，当鲜叶质量提高到48 g时，中蜂和意蜂对其提取的挥发物的EAG反应有下降的趋势；而凋落叶质量48 g时，中蜂和意蜂对其提取的挥发物的EAG反应达到最大值。

图1 意蜂和中蜂对凋落叶和鲜叶提取挥发物的EAG反应Fig.1 EAG response of A.mellifera ligustica and A.cerana cerana to volatiles from fallen and fresh leaves

2.1.2 中蜂和意蜂对相同质量鲜叶、凋落叶的挥发物EAG反应 相同质量(36 g)鲜叶、凋落叶提取的挥发物均能引起中蜂和意蜂产生不同程度的EAG反应。通过利用配对T检验表明，中蜂和意蜂之间对鲜叶的挥发性提取物反应差异达到显著(P＝0.030＜0.05)，而中蜂和意蜂之间对相同质量(36 g)凋落叶的挥发性提取物反应差异均不显著(P＝0.921＞0.05)。意蜂对36 g鲜叶提取的挥发物触角电位反应值较同质量凋落叶的高12.11%，中蜂对36 g鲜叶提取的挥发物物触角电位反应值较同质量凋落叶的高18.32%；说明中蜂和意蜂对鲜叶中挥发物的EAG反应相对更强(表1)。

表1 中蜂和意蜂对36 g叶片挥发物的EAG反应Tab.1 EAG responses of A.cerana cerana and A.mellifera ligustica to volatiles from 36 g leaves of E.grandis

2.2 中蜂和意蜂对巨桉叶片挥发物的行为反应

2.2.1 中蜂和意蜂对相同质量叶片提取的挥发物行为反应 配对T检验结果表明，中蜂和意蜂之间对36 g巨桉鲜叶提取的挥发物的引诱率均差异不显著(P＝0.529＞0.05)，中蜂和意蜂之间对36 g巨桉凋落叶提取的挥发物的引诱率差异也不显著(P＝0.899＞0.05)。但相比之下，鲜叶提取的挥发物对中蜂和意蜂的引诱率均高于凋落叶的，如36 g鲜叶提取的挥发物对中蜂的引诱率较凋落叶的高15.07%，对意蜂的引诱率较凋落叶的高25.14%。综上，相同质量(36 g)巨桉鲜叶提取挥发物对中蜂的引诱率值最高，而凋落叶提取的挥发物对中蜂引诱率值最低(表2)。

表2 巨桉36 g叶片提取的挥发物对中蜂和意蜂引诱率的比较Tab.2 Attaction rate of volatiles from 36 g E.grandis leaves to A.cerana cerana and A.mellifera ligustica

2.2.2 中蜂和意蜂对不同质量叶片提取的挥发物行为反应 通过测定中蜂、意蜂对挥发物的行为反应，发现中蜂和意蜂对不同质量(12，24，36，48 g)鲜叶和凋落叶提取的挥发物均有反应，且各处理提取物均表现出不同程度的引诱作用，生物测定结果与EAG反应结果基本一致(表3)。当味源为36 g鲜叶提取的挥发物时，挥发物对中蜂引诱率最高，当鲜叶高于或低于36 g时，其提取挥发物定向作用不明显；当味源为凋落叶提取的挥发物时，随挥发物含量升高，对中蜂的引诱率增大。通过卡方检验表明，在鲜叶为36 g时，其提取的挥发物对中蜂的引诱率差异达到显著(P＜0.05)，反应率为86.0%；在凋落叶48 g时，其提取的挥发物对中蜂的引诱率差异显著(P＜0.05)，反应率达86.5%。在味源为36 g鲜叶提取的挥发物时，其对意蜂引诱率达62.6%，差异显著(P＜0.05)，反应率较高，达85.3%；而48 g凋落叶提取的挥发物，对意蜂的引诱率为62.2%，差异显著(P＜0.05)，反应率为88.8%。

表3 中蜂和意蜂对不同质量巨桉叶片提取的挥发物行为反应Tab.3 Behavioral responses of A.cerana cerana and A.mellifera ligustica to volatiles from different mass of leaves of E.grandis

3 结论与讨论

植物挥发物作为植物产生的次生化学物质，是由植物表面和叶片组织中释放的挥发性化合物质。很多昆虫对寄主植物的识别是依据植物释放的特异性挥发物的化学指纹图，它们利用特异性挥发物作为寄主定位的线索[20]。毕拥国等[21]研究发现一些植物的挥发性气体能够引起天牛明显的行为反应；同时，植物挥发性气体还可以调控昆虫取食、产卵及交配等行为[22-23]。本研究中，发现巨桉鲜叶、凋落叶提取的挥发物均可引起中蜂和意蜂触角不同程度的EAG反应，且差异显著，表明巨桉鲜叶和凋落叶中所含挥发物的比例和含量存在差异。当鲜叶提取的挥发物升高到一定含量时，EAG反应值增加不显著甚至有所降低，说明鲜叶挥发物测试含量达到中蜂和意蜂的饱和阈限。36 g巨桉鲜叶提取的挥发物引起中蜂和意蜂的EAG反应相对强烈，而48 g巨桉凋落叶提取的挥发物引起中蜂和意蜂的EAG反应值最大。综上比较可知，巨桉鲜叶挥发物对中蜂和意蜂的EAG反应相对高于凋落叶，这说明叶片内化感物质的含量随叶片老朽晒干的过程而逐渐降低[24]。

所测定的巨桉鲜叶、凋落叶挥发物均能引起中蜂和意蜂嗅觉行为反应，并具不同程度的引诱作用。36 g巨桉鲜叶提取的挥发物对中蜂和意蜂的引诱率均达到最高，巨桉鲜叶高于或低于36 g时，其提取的挥发物定向作用不明显；表明各种昆虫对挥发物的反应都有一个最佳的含量范围，一般低于此范围时，反应率随含量的增加逐渐升高，高于时，反应率随含量增加而下降[25]；随着巨桉凋落叶挥发物含量的升高，对中蜂和意蜂的引诱率也增大，48 g巨桉凋落叶提取的挥发物对中蜂和意蜂有明显的引诱作用。生物测定结果与EAG反应结果基本一致。

综上所述，中蜂和意蜂对巨桉鲜叶提取的挥发物的EAG反应相对凋落叶更强，且在嗅觉行为反应中表现出更好的引诱效果。以此可看出，巨桉鲜叶和凋落叶挥发性提取物中均含有某种吸引中蜂、意蜂的物质，而鲜叶中含量更高，这也是巨桉影响中蜂、意蜂访花行为的原因之一。本试验中，仅研究了中蜂和意蜂对巨桉叶片挥发物的电生理反应和嗅觉行为反应，而巨桉叶片挥发物是否对巨桉林中其他植物的授粉存在影响还有待更多的研究探索。