广东省珠海地区淋球菌多抗原序列分型研究

刘小凤， 杜鹏， 郑和平， 吴兴中， 沈守星， 魏秋姣

(1.珠海市慢性病防治中心，广东 珠海 519000；2.南方医科大学皮肤病医院，广东 广州 510091)

淋病是由淋球菌(Neisseriagonorrhoeae)引起的常见性传播疾病。WHO估计2016年在15～49岁的人群中，淋病新发数为8 700万，女性的感染率为0.9%，男性为0.7%[1]。2018年我国淋病报告发病数位居乙类传染病的第4位[2]，广东为高发省份。珠海毗邻港澳，人口流动频繁，2014-2017年珠海地区淋病发病率逐年上升,其中2017年较2016年上升53.11%,2018年有所下降[3],控制淋病蔓延成为防控的重点。国际上普遍采用淋球菌多抗原序列分型(Neisseriagonorrhoeaemulitantigen sequence typing,NG-MAST)对淋球菌进行基因分型，该方法对淋球菌的分子流行病学以及基因的遗传和变异的研究提供很大的帮助[4-5]。本研究对珠海市2018-2019年全市性病监测哨点收集的淋球菌菌株进行了NG-MAST基因分型，初步了解其流行特点，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株收集

利用珠海市淋球菌耐药监测网络，于2018-2019年在全市16家性病监测哨点收集淋球菌菌株,共172株，所有菌株经革兰氏染色、分离培养、糖发酵以及氧化酶鉴定确定为淋球菌。

1.2 试剂与仪器

裂解液(达安公司)，PCR扩增试剂(TAKARA)。淋球菌培养皿(梅里埃公司)，PCR仪(ABI公司)，凝胶电泳仪(伯乐公司)。

1.3 淋球菌DNA的提取

将收集的淋球菌接种于GC培养皿，5%浓度CO2、36 ℃培养18～20 h。培养结束后挑取若干菌落于200 mL生理盐水中，13 000 rpm离心5 min，去上清，加入50 μL裂解液，100 ℃ 10 min后13 000 rpm 离心5 min，-20 ℃保存。

1.4 基因扩增与测序

淋球菌porB和tbpB基因片段扩增的引物和反应条件参照文献[6]进行，扩增结束后采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带。扩增产物送华大公司进行测序。

1.5 NG-MAST分型

porB基因序列以已知序列(GenBank号：M21289)为参考，截取第455位碱基开始的490 bp长的片段，tbpB基因序列以已知序列(GenBank号：U65222)为参考，截取第1 118位碱基开始的390 bp长的片段。将截取后的片段在www.ng-mast.net网站进行比对，最后综合各片段的型别在该网站获得该菌株型别。

1.6 系统进化树的绘制

采用MEGA6软件以NJ法绘制porB、tbpB、porB和tbpB整合基因片段的系统进化树。

2 结果

2.1 porB、tbpB、NG-MAST型别分布

172株菌株中,共获得82种porB基因型别、44种tbpB基因型别。porB和tbpB基因型别最多的前几位依次分别为por2978、por1135、por3215、por1132、por4843和tbp10、 tbp21、tbp110、tbp752、tbp470和tbp566，porB其他基因型别有77种，tbpB其他基因型别有38种。NG-MAST型别共79种，最多的为新型基因型别，其次为ST9659、ST5308、ST8140和ST2268，其他基因型别有74种。详见表1。

表1 porB、tbpB、NG-MAST型别分布Tab.1 The type distribution of porB，tbpB and NG-MAST

2.2 porB基因型与tbpB基因型的相关性

对porB基因型相对应的tbpB基因型进行分析，发现两者具有较好的相关性，por2978对应的优势基因型为tbp21，por3215和por4843对应的优势基因型为tbpB10。

2.3 porB、tbpB、NG-MAST系统进化树

如图1所示，三个基因系统进化树显示各基因具有高度多态性，porB基因可大概分为3组，大部分Bootstrap值大于50。tbpB基因可大概分为5组，由于基因片段长度短，序列具有高度同源性，特别是10基因型别，Bootstrap小于50。NG-MAST的系统进化树可大概分为3组，大部分Bootstrap值大于50。

图1 porB、tbpB、NG-MAST系统进化树Fig.1 The system evolution tree of porB,tbpB and NG-MAST.

3 讨论

目前淋球菌基因分型的方法主要有3种：多位点序列分型(multilocussequence typing,MLST)、抗菌素耐药性序列分型(sequence typing for antimicrobial resistance,STAR)和MAST。MLST主要用于乳糖奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的鉴别，STAR主要用于多重耐药淋病奈瑟菌的监测，且MLST、STAR法分析7个位点的操作相对复杂，耗时长。MAST只需要扩增porB和tbpB两个基因，操作简便，同时具有较好的区分能力，MAST 基因分型可用于分析不同地区临床分离株的遗传相关性，对某种基因型在世界各地的流行分布情况进行监控，主要用于多地区淋球菌的流行病学和抗生素耐受的研究[7]。

本研究收集了172株淋球菌，共获得82种porB基因型别，前三位分别为por2978(13株，占7.6%)、por1135(11株，占6.4%)、por3215(9株，占5.2%)，其它基因型别77种，共127株(73.8%)，其中绝大部分1种基因型只有1株(46/82,61%)或2株(19/82,23.2%)菌株，珠海地区没有明显的porB基因型优势菌株。据报道山西太原地区porB的流行基因型为por1132、por2001、por6993[8]，湖南长沙地区的为por3466、por2978、por4197和por90[9]，广东地区未见报道，表明porB基因型具有地区差异。tbpB基因型别有44种，相对于porB，分布更为集中，前三位分别为tbp10(37株，21.5%)、tbp21(26株，15.1%)、tbp110(13株，7.6%)，其它基因型别38种，共77株(44.7%),其原因可能是由于tbp基因的同源性较高，分辨力不如porB基因。黄美容等[10]对遵义地区65株淋球菌菌株进行NG-MAST分型，发现tbp33、tbp4、tbp21为优势基因型，而广东地区暂未发现tbpB优势基因型的报道。综合两者的序列，研究得到79种淋球菌的NG-MAST型别，ST最多的基因型依次为ST9659(9株，5.2%)、ST5308(6株，3.5%)、ST8140(6株，3.5%)，没有明显的优势基因型。本研究的ST基因型与其它研究有很大的差异，如广东地区为ST568、ST270、ST421[11]，广州地区为ST1768、ST2083、ST10229[12]，福建三明市和泉州市ST优势菌株为ST1927和ST1866[13]，浙江萧山市优势基因型是ST18661和ST1927和ST3102[14]。本研究中ST型别单一菌株较多，同时新的基因型别占了33.7%，与Qin等[15]对广东地区淋球菌NG-MAST分型发现新基因型占38%的研究结果相似，说明 ST基因库中来自我国的数据比较少，需要我国研究者进一步完善。研究显示porB基因型与tbpB基因型具有较好的相关性，por2978对应的tbp21，por3215和por4843对应的tbpB10，是珠海地区的常见基因型，需要特别关注。

从基因系统进化树可以看出，porB、tbpB和MAST型别均具有高度的多态性。在porb基因型进化树中，虽然por2978和por1135在同一大簇中，但进化关系相对较远。由于tbpB基因片段较短，同源性较高，同一基因型内菌株进化关系不易区分，占比居前的tbp10、tbp21、tbp110位于不同大簇内。NG-MAST系统进化树可大致分为3个大簇，其中ST5308、ST8140位于同一个大簇，具有一定的生物进化关系。珠海地区淋球菌的遗传背景具有高度的多态性，可能原因有：①研究的菌株数量不足；②性伴的菌株没有收集到；③菌株的选择压力过大，基因重组频繁；④人口流动频繁，存在较多的ST型别。

各地区流行菌株遗传背景的多态性与新基因型的流行表明了淋球菌NG-MAST分型对淋球菌防治的重要性，需重点关注珠海淋球菌的优势菌株。由于本研究缺少流行病学数据，无法建立淋球菌的性网络，接下来需完善流行病学调查资料，并将NG-MAST分型与菌株的耐药性相结合，以进一步为淋病的防治提供帮助。