基于线粒体Cyt-b序列的太湖湖鲚与短颌鲚种群遗传分析*
2020-07-26轩中亚刘洪波陈修报
轩中亚 姜 涛 刘洪波 陈修报 杨 健,
基于线粒体Cyt-b序列的太湖湖鲚与短颌鲚种群遗传分析*
轩中亚1姜 涛2刘洪波2陈修报2杨 健1,2①
(1. 南京农业大学无锡渔业学院 无锡 214081；2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心中国水产科学研究院长江中下游渔业生态环境评价与资源养护重点实验室 无锡 214081)
为了解太湖的湖鲚()与短颌鲚()的遗传多样性及遗传分化情况，利用线粒体细胞色素b(Cyt-b)基因，开展了种群遗传学研究。结果显示，47条序列共有变异位点26个，其中，简约信息位点12个，共得到22个单倍型。两物种间st值达0.703，分化程度较高，种群间的基因流仅为0.212。湖鲚种群内平均Kimura双参数遗传距离为0.002，短颌鲚种群内为0.001，而湖鲚与短颌鲚种间平均Kimura双参数遗传距离为0.005，湖鲚与短颌鲚种间遗传距离高于湖鲚种群内部遗传距离，也高于短颌鲚种群内部遗传距离。系统发育树和单倍型网络图结果显示，湖鲚与短颌鲚分成2个大的类群，但有1个湖鲚个体与短颌鲚具有共有单倍型。总体结果显示，湖鲚与短颌鲚之间存在明显的遗传分化，Cyt-b序列可用于区分湖鲚与短颌鲚个体。
湖鲚；短颌鲚；Cyt-b；遗传分化
鲚属()隶属于鲱形目、鳀科，是我国常见的经济鱼类。一般认为，我国分布的鲚属鱼类有4种，即刀鲚()、凤鲚()、七丝鲚()和短颌鲚() (袁传宓等, 1976、1980)。另外，在太湖、巢湖等长江附属湖泊中分布有能自然繁殖的刀鲚定居型群体，袁传宓等(1976)将此群体定为刀鲚的亚种，即太湖湖鲚()。目前，湖鲚为太湖鱼类组成的绝对优势种群(刘恩生等, 2005; 毛志刚等, 2011)，关于太湖湖鲚的生长特征(毛志刚等, 2011)、生殖特性(孙雪兴等, 1987)、种群数量变动(刘恩生等, 2005)、食物组成(王银平等, 2016)等方面已有研究。然而，实际上太湖的鲚属鱼既有上颌骨长度大于头长的个体，也有上颌骨长度小于头长而符合短颌鲚定义(袁传宓等, 1976、1980)的个体，但多数研究者将太湖内的鲚属鱼类都归为太湖湖鲚(唐文乔等, 2007; 许志强等, 2009; 周晓犊等, 2010)，只有少数研究者(Yang, 2010)在其研究中将太湖中的短颌鲚与湖鲚分别叙述。
基于生化和形态特征(刘文斌等, 1995)，线粒体序列(唐文乔等, 2007; 许志强等, 2009; 周晓犊等, 2010; 张凌, 2012)，核基因AFLP分析(Yang, 2010)都得出湖鲚、短颌鲚与刀鲚之间未达到亚种、种分化程度的结论，认为湖鲚、短颌鲚都只为刀鲚的淡水生态型。然而，由于湖鲚定义较难界定，在涉及湖鲚的研究中，存在误将太湖中的短颌鲚个体当做湖鲚的可能，进而导致遗传分析结论的客观性存疑。近期，有研究(程方圆等, 2019)开发了可以用来区分短颌鲚与刀鲚、湖鲚与刀鲚的SNP位点。然而，对于湖鲚与短颌鲚之间的分化程度和可区分度，仍需进一步研究。
线粒体DNA(mtDNA)具有母系遗传、结构简单无内含子、缺少重组、进化速率较快的特点(Rosel, 2017; DeSalle, 2017)，已被广泛用于物种鉴定和遗传多样性研究。其中，线粒体细胞色素b (Cyt-b)基因进化速率适中，适合种群水平遗传差异的检测，被广泛应用于水产动物群体遗传多样性和遗传分化研究中(Ma, 2011; 李大命等, 2017; 周华兴等, 2019)。本研究室前期的工作中开发了利用鲚属鱼类线粒体序列区分刀鲚、凤鲚、七丝鲚早期生活史个体的方法(孙超等, 2018)，证明了线粒体序列用于判别鲚属鱼类的潜力，为了解湖鲚与短颌鲚之间尤其是共同分布在太湖内的湖鲚与短颌鲚之间的遗传分化程度和可区分度提供了可能。因此，本研究拟通过对太湖区域内同水域存在的湖鲚与短颌鲚mtDNA Cyt-b全序列的测定和分析，来尝试评估其遗传多样性，探讨其遗传分化关系，以期为其分化程度的把握、今后资源的区分及相关的保护和开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 样本采集及DNA提取
47尾活体鲚采自太湖无锡鼋头渚游船码头附近水域渔船的渔获物，立即取少量肌肉组织固定在95%的乙醇中，其余鱼体保存在放置了冰盒的便携式采样箱中，带回实验室后均保存在–20℃冰箱中备用，解剖前测量全长、体重、上颌骨长、头长等数据，并计算上颌骨长/头长的值以区分湖鲚与短颌鲚，上颌骨长/头长低于1的为短颌鲚，高于1的为湖鲚(袁传宓等, 1976) (表1)。DNA提取采用康为世纪生物科技有限公司的柱式基因提取试剂盒，按照说明书进行操作。提取后的DNA溶液在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，以检测其质量。检测合格后保存在–20℃备用。
1.2 mtDNA扩增及测序
参照刀鲚线粒体全基因组序列(Zhao, 2016)，通过Primer premier 5.0软件(Singh, 1998) 设计引物(F: CAACCAGACCCAAAATCAAT, R: CT TTGGGAGCTAGTGGTGG)用于扩增Cyt-b序列，该对引物扩增的区域包括刀鲚Cyt-b序列全长及上下游其他基因部分序列，以保证测序结果的准确性。
PCR扩增反应混合物体系包括：100 ng DNA模板，12.5 μl 2×Master Mix(康为世纪生物科技有限公司)，引物(10 mmol/L)各0.5 μl，加蒸馏水至终体积25 μl。PCR反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，58.1℃退火45 s，72℃延伸90 s，共30个循环；最后，72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，然后，用上海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-1柱式PCR产物纯化试剂盒进行纯化回收，对产物使用ABI3730XL测序仪(天霖生物技术有限公司)进行双向测序。
1.3 数据分析
正反序列经过组装后辅以人工校正，得到一致序列，校对后的序列在GenBank中进行BLAST搜索，确定是目标Cyt-b序列。对获得的序列在BioEdit软件(https://bioedit.software.informer.com)中进行多重比对，检视比对过的结果，手工去除多余的碱基，获得1141 bp的Cyt-b全序列。从文献中下载刀鲚Cyt-b序列(登录号FJ460629-FJ460640, FJ460669-FJ460680)与本实验获得的湖鲚、短颌鲚共同用于分析系统发育关系。另外，从GenBank中下载七丝鲚与凤鲚的Cyt-b序列，与本研究所获得的湖鲚与短颌鲚序列进行遗传距离的计算。
由DnaSP软件(Rozas, 2003)输出单倍型文件，由Popatr软件(http://popart.otago.ac.nz)构建median joining network (MJN)以分析单倍型之间的关系。采用Arlequin软件(Excoffier, 2005)计算两种群间的st值，用以检验种群遗传结构，通过10000次重抽样检验其显著性。MEGA7软件用于计算基于Kimura two-parameter(K2P)模型的种间的平均遗传距离和各自种群内部的平均遗传距离(Kumar, 2016)。通过DAMBE软件进行碱基替换的饱和性检验(Xia, 2001)：基于转换和颠换对K2P遗传距离作图分析和指数ISS检测，以检验Cyt-b序列是否适合用于分析系统发育关系。以凤鲚、七丝鲚作外类群，在MEGA7软件中计算整体序列的平均遗传距离以判断是否适合邻接法(Neighbor-joining method, NJ)建树，平均距离计算过程中误差评估采取Bootstrap法，重复次数为1000次。基于K2P模型采用邻接法构建系统发育树，各分支的支持率采用1000次Bootstrap检验。
表1 太湖湖鲚与短颌鲚的上颌骨长/头长、全长、体重
Tab.1 The ratio of the supermaxilla length to head length, total length and body weight in C. nasus taihuensis and C. brachygnathus collected from the Taihu Lake
2 结果
测序共得到47条序列，经BLAST比对，确定是目标序列，比对后使用BioEdit软件截取1141 bp的Cyt-b全序列(序列已提交到GenBank)。经DnaSP软件检测，共有变异位点26个，其中，简约信息位点12个，共得到单倍型22个。湖鲚具有单倍型19个，其中，湖鲚特有单倍型18个；短颌鲚中具有单倍型4个；湖鲚与短颌鲚共享1个单倍型，该单倍型对应的9个个体中，有1个个体为湖鲚，其他都是短颌鲚。
根据上颌骨长度与头长之比将样本分为湖鲚与短颌鲚2个种群(表1)，两种群间基于的Cyt-b序列的固定指数st值达0.703(表2)，分化程度较高；两种群间的基因流仅为0.212，显示两种群之间的基因流十分微弱。st的值在统计上达到了显著水平(< 0.001)。
湖鲚和短颌鲚种群内平均Kimura双参数遗传距离分别为0.002和0.001，而湖鲚与短颌鲚种群间平均Kimura双参数遗传距离为0.005，高于湖鲚和短颌鲚种群内部的平均Kimura双参数遗传距离。但湖鲚与七丝鲚的遗传距离为0.034，与凤鲚的遗传距离为0.086；短颌鲚与七丝鲚的遗传距离为0.033，与凤鲚的遗传距离为0.085，远高于湖鲚与短颌鲚之间的遗传距离(表3)。
表2 不同种类间的st值与基因流
Tab.2 Fst value and gene flow between C. nasus taihuensis and C. brachygnathus
注：对角线下方为成对间st值，对角线上方为基因流。 “***”表示st的显著水平(<0.001)
Note: Under catercorner:stbetween populations; Above catercorner: Gene flow between populations. “***” indicates thestreaches significant level at<0.001
Cyt-b序列的碱基替代饱和度检验结果显示，对称的进化树和非对称的进化树其Iss.c值均大于Iss值，且差异极显著(双尾检验=0.0000)，这表明碱基替换未饱和，适合构建系统进化树。经检验，整体平均距离为0.013(0<0.013<1)，适合构建NJ系统发育树。在NJ系统发育树上，22个单倍型构成了2个大的分支，其中一个分支的4个单倍型中，3个为短颌鲚的单倍型，1个为湖鲚、短颌鲚的共享单倍型，另一个分支的18个单倍型全部为湖鲚的单倍型(图1)，两大主要分支之间的支持度达到100。基于湖鲚与短颌鲚的Cyt-b序列构建的单倍型网络图分为截然不同的两部分(图2)，在A部分与B部分之间的变异步数较大。A部分里，主要是湖鲚的特有单倍型；B部分里，1个湖鲚个体具有该单倍型。从GenBank下载的刀鲚单倍型与湖鲚、短颌鲚单倍型共同构建NJ系统发育树上，46个单倍型仍然构成2个大的分支，其中一个分支上的4个单倍型中，3个为短颌鲚的单倍型，1个为湖鲚、短颌鲚的共享单倍型，另一个分支上的42个单倍型为湖鲚与刀鲚的单倍型，湖鲚与刀鲚单倍型互相交杂，共同构成一个大的分支(图3)，两大主要分支之间的支持度达到99。
表3 湖鲚、短颌鲚与凤鲚种类间及种类内平均Kimura双参数遗传距离
Tab.3 Mean value of the Kimura’s two-parameter distance between and within C. nasus taihuensis,C. brachygnathus, C. grayii and C. mystus
注：对角线下方为种群间平均遗传距离，对角线为种群内平均遗传距离
Note: Under catercorner: Genetic distance between populations; On catercorner: Genetic distance within populations
图1 基于湖鲚、短颌鲚Cyt-b基因序列构建的邻接法(NJ)系统进化树
分支上的数字为自举检验支持率
Numbers on each branch refer to bootstrap value
图2 基于Cyt-b单倍型构建的单倍型网络关系图
圆的大小代表单倍型频率，横线代表突变步数
The size of circles are corresponded to haplotype frequency, the number ofvertical bars on the line indicates the steps of substitutions separating two haplotypes
3 讨论
在本研究中，湖鲚与短颌鲚间的平均遗传距离为0.005，高于湖鲚、短颌鲚各自内部的平均遗传距离，但远低于湖鲚、短颌鲚分别与凤鲚、七丝鲚之间的遗传距离。这一结果与唐文乔等(2007)、周晓犊等(2010)、张凌(2012)、许志强等(2009)基于线粒体研究得出刀鲚、湖鲚、短颌鲚之间的遗传距离的结果相似。本研究基于Cyt-b序列使用NJ法得出的系统发生树及单倍型网络关系图都显示，除1个湖鲚个体具有共享单倍型外，湖鲚与短颌鲚分为截然不同的2个支系，显示了利用该方法进行湖鲚与短颌鲚早期生活史个体区分的潜力。同时，为了进一步验证该方法的可靠性，作者加入了从GenBank上下载到的刀鲚Cyt-b单倍型序列，发现湖鲚与刀鲚构成一个大的支系，且相互混在一起，而短颌鲚构成另一个大的支系(图3)，表明了该方法的可靠性。袁传宓等(1976)指出，湖鲚为“定居型刀鲚”，并指出刀鲚上颌骨长超过头长，短颌鲚上颌骨较短一般不超过头长。在本研究中，湖鲚(上颌骨长/头长>1)与刀鲚的单倍型聚在一起，相互混杂，显示刀鲚与湖鲚之间缺乏遗传分化，为湖鲚是“定居型刀鲚”的观点提供了证据。另外，王倩等(2017)等基于大量单拷贝核基因SNP分析了长江刀鲚与洞庭湖短颌鲚，证明刀鲚、短颌鲚之间具有明显的遗传分化，已经达到了种间分化的程度。那么湖鲚作为定居型的刀鲚，与短颌鲚之间也应该具有遗传分化，而本研究的结果证实了这一点。本研究中，湖鲚与短颌鲚分为截然不同两支系的情况与前人研究有所不同。在唐文乔等(2007)、周晓犊等(2010)、张凌(2012)的研究中，仅指出其研究中湖鲚的采样地点为太湖、巢湖，未对上颌骨长/头长进行描述。许志强等(2009)的研究中报道了湖鲚样本的上颌骨长/头长范围为0.882~ 1.133，显示这批样本中有部分个体的上颌骨长是小于头长的。同样，袁传宓等(1980)研究也发现，太湖中同时存在上颌骨长/头长>1、上颌骨长/头长<1两种形态的鲚鱼。那么，在上述的遗传分析中，很可能有将湖中的短颌鲚当作湖鲚分析的情况，由此得出的短颌鲚与湖鲚遗传上不能区分的结果显然不够可靠。本研究在区分上颌骨长/头长比率这一形态差异的基础上进行的遗传分析发现形态差异与遗传差异具有良好对应关系，即上颌骨长/头长>1的湖鲚与上颌骨长/头长<1的短颌鲚之间是具有明显遗传分化的。因此，建议在今后关于湖鲚的研究中明确湖鲚的定义，即湖鲚为定居型刀鲚，避免将同一湖泊内共存的湖鲚与短颌鲚混淆。同时，湖鲚与短颌鲚的形态型与Cyt-b遗传型之间良好的对应关系，显示了Cyt-b序列在区分形态上难以区分的湖鲚与短颌鲚的卵及仔稚鱼等早期生活史个体方面的应用潜力。
图3 基于刀鲚、湖鲚、短颌鲚Cyt-b基因序列构建的邻接法(NJ)系统进化树
分支上的数字为自举检验支持率，r表示从GenBank上下载的刀鲚Cyt-b序列
Numbers on each branch refer to bootstrap value, r representsCyt-b sequences ofdownloaded from GenBank
本研究结果显示，湖鲚与短颌鲚之间的固定系数st达0.703，基因流为0.212。Wright(1965)提出的遗传分化范围(st<0.05，低度分化；0.05
本研究中湖鲚与短颌鲚之间存在的共享单倍型应该是不完全谱系分选或渐渗杂交的结果。Avise等(2000)提出，物种形成初期的物种首先形成一个复系的类群，之后会演化成并系的类群，最终形成互为单系的簇，湖鲚、短颌鲚之间尚未达到单系，表明它们之间的分化可能仍处于较早的阶段，相同的祖先单倍型仍残留在不同的种群中，最终可能会在遗传漂变等因素的作用下，共享单倍型在其中一个种群中固定下来，成为其特有单倍型(Funk, 2003; Tang, 2012)，本研究共有单倍型较低的出现频率也暗示了这一点。除了不完全谱系分选，渐渗杂交也可能是共享单倍型出现的原因(Rapson, 2012; Zhang, 2018)。因此，对湖鲚与短颌鲚之间的共有单倍型，另一个可能的解释就是湖鲚与短颌鲚之前已经分化为2个不同的支系，但仍存在杂交的潜力，发生过渐渗杂交。湖鲚与短颌鲚都属于淡水定居生态型，具有类似的形态和生态特征，并且在太湖中处于陆封状态，产卵时间、产卵场所都具有较大重叠(袁传宓等, 1976)。然而，湖鲚与短颌鲚之间较高的遗传分化、较低的基因流显示它们之间的基因交流程度很低。这似乎显示了湖鲚与短颌鲚之间存在生殖隔离，正是这种生殖隔离机制阻止了湖鲚与短颌鲚之间自由交配，维持了形态与谱系之间的对应关系。而对于这种生殖隔离的程度与机制，目前的数据还不能精确得出结论，尚需进一步的研究核基因及其生态特征以获得更多的信息。
本研究结果显示，太湖中同域存在的湖鲚与短颌鲚种群之间具有高度的遗传分化，种群间基因流微弱；除少数共享单倍型外，在系统发育树上形成相互独立的支系。这就相应提示研究者，在今后进行相关研究时，宜注意区别对待湖鲚与短颌鲚个体。同时，也为湖鲚与短颌鲚早期生活史个体的判别提供了一种相对可靠的方法。当然，要更准确全面地了解湖鲚与短颌鲚的精细遗传结构和更准确的判别方法，尚需要进一步扩大采样范围，并应用其他线粒体、微卫星等分子标记，进一步开展深入的分析探索。
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Genetic Divergence ofandPopulations Based on the Mitochondrial Cyt-b Gene
XUAN Zhongya1, JIANG Tao2, LIU Hongbo2, CHEN Xiubao2, YANG Jian1,2①
(1. Wuxi Fisheries College, Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081; 2. Key Laboratory of Fishery Eco-Environment Assessment and Resource Conservation in Middle and Lower Reaches of the Yangtze River, Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081)
has become a dominant species of fish in Taihu Lake, China. However,is often confused with, and identification problems still exist today. The fish with length ratio of supermaxilla/head > 1 are believed to be the former species, while those with length ratio of supermaxilla/head < 1 are believed to be the latter. Asprevious studies have classified all of thefish in Taihu Lake as, there are doubts about the accuracy of the results of these studies on genetic differentiation betweenand. In light of the above information, we have used morphological features to distinguish betweenanddetermined genetic divergences among the two putative species, and tested whether the Cyt-b sequence can identify unknown individuals at early life stages betweenand. In the present study, we have determined the genetic diversity, genetic structure, genetic divergence, and population demographic history between the two phenotypes ofandusing the mitochondrial Cyt-b gene. A total of 22 haplotypes were found among 47 sequences of the Cyt-b gene, from the 33 individuals ofand 14 individuals of. The results showed that 26 polymorphic nucleotide sites were detected among all of the Cyt-b sequences, including 12 parsimony-informative sites. The value of Kimura’s two-parameter distance forandwas 0.002 and 0.001, respectively. Moreover, the value of Kimura’s two-parameter distance amongand, was 0.005. This situation means that the genetic divergence among the two putative species was higher than that within each species.Fanalysis showed a significantly higher level of genetic variance among the two putative species (F=0.703,≤0.001). The gene flow between the two putative species was 0.212, lower than 1, and suggesting that the two phenotypes had almost no gene exchange. Additionally, two distinct clades were detected by phylogenetic analysis, and they were forand, respectively. A haplotype was shared by these phenotypes. Furthermore, the median-joining network produced was similar to the topology of the phylogenetic tree. In summary, mtDNA analysis of this study revealed that there were significant genetic divergences betweenand, the gene flow between them was weak, and two distinct clades could be detected by phylogenetic analysis, and the Cyt-b sequence could be used to differentiate at early life stages betweenand.
;;Cyt-b;Genetic divergence
YANG Jian, E-mail: jiany@ffrc.cn
Q958.8
A
2095-9869(2020)04-0033-08
10.19663/j.issn2095-9869.20190419006
http://www.yykxjz.cn/
轩中亚, 姜涛, 刘洪波, 陈修报, 杨健. 基于线粒体Cyt-b序列的太湖湖鲚与短颌鲚种群遗传分析. 渔业科学进展, 2020, 41(4): 33–40
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* 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(2017JBFR02; 2018GH14)和江苏省科技项目(BK20160204)共同资助 [This work was supported by Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund (2017JBFR02; 2018GH14), and Science and Technology Projects of Jiangsu Province (BK20160204)]. 轩中亚，E-mail: 963531709@qq.com
杨 健，研究员，E-mail: jiany@ffrc.cn
2019-04-19,
2019-05-09
(编辑 冯小花)
