高血压早期心肌应力及细胞外间质容积的动物实验研究

庄白燕，崔辰，何健，王学民，王欣，段雪晶，王红月，赵世华，陆敏杰

高血压性心脏病会引起一系列左心室(Left ventricle，LV)异常改变，包括左心室形态改变、左心室肥厚、收缩和舒张功能障碍。研究证明高血压是发生重大心脏不良事件的主要危险因素[1]，及早诊断和控制原发性高血压患者的血压及左心室功能改变，可以从根本上减少心血管事件的发生率和病死率。高血压性心脏病的干预应以早期功能监测和治疗为重点，常规影像学检查很难评估高血压心脏病早期的心脏结构及功能改变，但是射血分数等心功能参数的异常多发生在心肌疾病的晚期，因此左心室功能早期监测一直未能实现[2]。近年来，心脏磁共振特征追踪(cardiac magnetic resonance feature tracking，CMR-FT)技术被认为是目前测量应变的有效手段，CMR-FT主要针对心脏内、外膜边界，检测腔-组织界面的内、外运动，可量化不同层次心肌运动的状态[3]，是心脏功能的敏感指标。另外，T1-mapping 技术可以直接定量测定心肌组织的T1值从而定量评估心肌损伤的程度和范围，准确评价多种心肌病变的心肌组织特征[4-6]。细胞外间质容积分数(extracellular volume，ECV)基于平扫T1值、增强后T1值，同时引入了血细胞比容的值进行校对，因而可有效避免干扰因素，更加稳定、精准地反映心肌间质改变的严重程度及范围。本课题组前期进行的临床研究发现T1及ECV较钆对比剂延迟强化(late gadolinium enhancement，LGE)更敏感地发现高血压心肌纤维化[7]，但因临床研究缺乏病理证据，也未进行心肌应力的功能学研究。本研究拟以病理为金标准，联合应用CMR-FT及T1-mapping评估高血压早期心脏结构、功能及心肌组织特征改变。

材料与方法

1.实验动物

本研究前瞻性纳入了19头健康中国雄性小型猪(高血压组13头，对照组6头)，6～12个月，体重20～25 kg。对于高血压组，通过结扎左肾动脉建立高血压动物模型[8]。进行基线MRI扫描后，在麻醉后做垂直腹部切口，分离肾动脉和肾静脉，游离长度0.5～1.0 cm。将直径为0.25 mm的针头置于动脉上方，将缝合线牢固地绑在针头和血管周围，然后取出针头。对照组(假手术组)除未结扎左肾动脉外，其余操作均与实验组相同。所有动物术后均接受抗细菌治疗以预防感染(头孢唑啉1.0 g，肌肉注射，每天两次，连续3天)，术后镇痛使用丁丙诺啡(0.3 mg，每天两次，连续3天)[9]。

2.CMR扫描方法

对实验组和对照组中的所有动物都在基线，手术后6个月进行了CMR检查，所有CMR检查均在Philips 3.0T MR上进行(Ingenia，Philips Healthcare，Best，Netherland)。心脏短轴电影序列：采用稳态自由进动梯度回波(steady state free precession，SSFP)技术，从心底到心尖以进行无间距连续扫描，结合心电及呼吸屏气采集短轴电影序列(视野321 mm×321 mm，矩阵180×200，层厚8 mm，TR 3.10 ms，TE 1.56 ms，翻转角45°，时间分辨率43 ms，并行采集系数2)。LGE：对比剂注射后10 min，采用心电门控屏气相位敏感反转恢复PSIR序列，在与心脏电影图像相同的横截面位置扫描(视野350 mm×321 mm，矩阵192×132，层面厚度8 mm，TR 6.1 ms，TE 3.0 ms，翻转角25°，并行采集系数2)。T1-mapping：使用改良的Look-Locker反转序列(MOLLI)，在给予对比剂之前和经耳缘静脉高压注射器给予对比剂(0.15 mmol/kg)15～20 min之后，在四腔，两腔和三个左心室短轴(基底、中间和心尖平面)层面扫描。心尖短轴定义为紧邻心尖帽的一层，心室中间短轴定义为位于乳头肌中部的一层，基底短轴定义为在电影成像中显示心室腔内血池的最后一层。成像参数：视野300 mm×300 mm，矩阵152×150，层厚5 mm，TR 2.30 ms，TE 1.03 ms，翻转角20°，并行采集系数2。

3.CMR图像分析

心功能：采用图像后处理软件CVI 42(Circle Cardiovascular Imaging Inc，Calgary，Canada)进行左心室心功能检测。心内膜和心外膜的轮廓通过半自动检测获得并进行手动校正。心室腔包括乳头肌和心肌小梁在内。舒张末期和收缩末期分别定义为心动周期中心室最大和最小的时期[10]。心功能参数包括左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒张末期直径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左心室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、左心室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume，LVESV)、左心室每搏量(left ventricular stroke volume，LVSV)、左心室心输出量(left ventricular cardiac output，LVCO)和左心室舒张末期质量(left ventricular mass at end-diastole，LV mass at ED)。并将上述心功能参数根据体表面积(body surface area，BSA)标准化，得到相应的指数参数。

应力和应变率：采用QStrain软件(QStrain 2.0，Medis BV，Leiden，Netherland)在SSFP电影图像中分析应力和应变率，在指定模块中打开短轴及长轴电影序列，勾勒左心室内、外膜，手动调整心内膜与心外膜边界处的曲线，使其与室壁厚度保持一致，然后运行程序，自动计算左心室应力及应变力。参数包括径向应力(radial strain，RS)，径向收缩期应变率和舒张早期应变率(radial systolic strain rate and early diastolic strain rate，RSRS，RSRE)，周向应力(circumferential strain，CS)，周向收缩期应变率和舒张早期应变率(circumferential systolic strain rate and early diastolic strain rate，CSRS，CSRE)(图1)，纵向应力(longitudinal strain，LS)，纵向收缩期应变率和舒张早期应变率(longitudinal systolic strain rate and early diastolic strain rate，LSRS，LSRE)(图2)[11]。

图1 左室整体径向、周向应力及应变率测量。a)心脏内外膜描记方法示意图，其中橙色圆圈为内膜，绿色圆圈为外膜；b)电影图像上测量径向及周向应力及其变化的曲线图，其中径向应力为(蓝线)，周向应力为(红线)；c)电影图像上径向收缩期应变率及舒张早期应变率及其变化的曲线图；d)电影图像上周向收缩期应变率及舒张早期应变率及其变化的曲线图。 图2 左室整体纵向应力及应变率测量。a)心脏长轴内外膜描记方法示意图，其中橙线为心内膜，绿线为心外膜；b)电影图像上测量纵向应力及其变化的曲线图；c)电影图像上纵向收缩期应变率及舒张早期应变率及其变化的曲线图。

LGE：采用盲法，使用CVI42软件进行分析，使用全宽/半最大值方法对LGE进行半自动定量分析[12]。测量过程中手动校正排除血池或心包的部分容积伪影。

ECV：在CVI 42软件上进行分析，心内膜和心外膜的轮廓通过半自动检测后手动校正。根据美国心脏协会推荐的心肌17节段法，本研究测量并计算了心肌各节段的ECV值(因为无法获得心尖值，因此删除了心肌的第17段)。ECV的计算基于增强前和增强后T1-mapping的数据，使用以下公式：ECV(%)=(1-Hct)·(ΔR1 myo/ΔR1blood)·100%，其中ΔR1myo =(1/T1myo增强后-1/T1myo增强前)，ΔR1blood=(1/T1blood增强后-1/T1blood增强前)分别是心肌和血池增强前后的差值，HCT为血细胞比容[13]。

4.病理

在最后一次MR扫描后处死动物，在麻醉下静脉注射20 mL 15%(v/w)氯化钾，直至动物心脏停跳。将取出的心脏浸入95%乙醇中20 min固定，预冷至-80℃，然后由经验丰富的病理医生从下至上将心脏切成6 mm厚的短轴切片。然后将切片浸入37℃水浴的1%的三苯基氯化四唑(TTC)溶液中10 min。根据标志点(如乳头肌和右心室插入点等)将TTC图像与CMR图像进行匹配。这个过程由放射科医生和病理科专家共同完成。然后由病理科专家进行HE、Masson和天狼星红染色。使用半自动图像分析软件(ImageJ _v1.8.0)，以胶原纤维面积占心肌总面积的百分比来确定胶原纤维体积分数(collagen volume fraction，CVF)。

5.统计学分析

采用 SPSS 22.0软件进行分析，连续变量表示为平均值±标准差。使用Kolmogorov-Smirnov's检验连续变量是否是正态分布。采用配对t检验或Wilcoxon秩和检验(取决于数据是否正态分布)比较组与组之间的差别。以P<0.05为差异有统计学意义。使用Pearson相关和线性回归模型分析应变与ECV之间的关系。

结 果

在19只动物中，高血压组的一只动物在术后6天死于感染(死亡率5.0%)。因此最终共18只猪纳入分析(高血压组12只，对照组6只)，对所有动物成功地进行了两次MRI检查并获得了病理学染色。

1.LV形态和功能改变

对照组的血压和心功能在基线和术后6个月之间无明显差异。高血压组中，，手术后6个月的收缩压和舒张压从102/71 mmHg增加到145/86 mmHg。高血压组造模前后的左心室舒张末期容积指数无明显差异(61.9±4.6 mL/m2、66.6±10.4 mL/m2，P= 0.96)。平均LVEF在基线时为(72.7±1.4)%，在手术后6个月为(69.9±3.5)%(P= 0.34)。两组的详细血压和心功能参数见表1。

表1 高血压组与对照组左心室心功能及血压情况

2.LV心肌应变

左心室的整体RS、RSRS、RSRE、CS、CSRS、CSRE、LS、LSRS、LSRE见表2。高血压组和对照组之间除RSRS、RSRE及 CSRS外，所有应力和应变率均差异均有统计学意义(P均<0.05)。术后6个月，高血压组的RS(从46.05～30.40)、LS(从-18.06～-12.51)、CSRE(从1.52～0.92)、LSRE(从1.35～1.01)显著降低(P<0.05，表2，图3)，而对照组没有显著变化。在应变与ECV的相关性分析中发现，心肌ECV与RS呈负相关(r=-0.74，P=0.01)，与LSRE呈负相关(r=-0.92，P<0.001)，与CSRE呈负相关(r=-0.65，P=0.02)，见图4。

表2 高血压组和对照组的详细应力和应变率数值

图4 ECV与应力及应变率的相关性研究，实线条表示最佳拟合线和均值的95%置信区间。a)ECV与RS的相关性；b)ECV与CSRE的相关性；c)ECV与LSRE的相关性。

图3 高血压组基线和造模后6个月的一个心脏周期内的应力和应变率。造模后6个月的RS、RSRS、RSRE、CS、CSRS、CSRE、LS、LSRS和LSRE均减小。a)RS；b)CS；c)LS；d)RSR；e)CSR；f)LSR。

3.心肌组织特征

在手术前后的各个阶段，对照组和高血压组均未检测到LGE。但是高血压组与对照组之间的ECV值差异具有统计学意义(P=0.02)。高血压组术前、手术后6个月的总体ECV差异具有统计学意义(21.7±1.2，29.2±4.1，P=0.03)。造模前后心脏的ECV详细分段对比见表3。

表3 高血压组与对照组各节段造模前、造模后6个月的ECV值

4.病理

在手术后获得的切片中，TTC大体染色均未观察到明显的心肌异常表现，进一步的组织学染色(HE、Masson和天狼星红)可以看出基线无明显异常，术后6个月左心室出现了明显心肌间质纤维化(图5)，左心室17个节段的CVF见表4。另外，CVF与RS具有很好的相关性(r=-0.61，P=0.03，图6)。

图5 TTC染色(第一行)、ECV图像(第二行)、native T1图像(第三行)、LGE(第四行)和ROI 1的HE、Masson和天狼星红染色(第五行，×200)。ECV的色阶范围为1%～60%；native T1的色阶范围为500～2000 ms；TTC染色没有明显的异常表现；LGE图像中没有明显的信号强度增加。a)基线，ECV没有明显增加(ROI1 = 20.0%)，HE，Masson和天狼星红染色中没有明显的心肌纤维化；b)术后6个月，左心室native T1及ECV明显增加。HE、Masson和天狼星红色染色显示术后6个月左室出现明显的间质纤维化。

图6 CVF与RS呈负相关，实线条表示最佳拟合线和均值的95%置信区间。

表4 高血压组17个节段造模前、造模后6个月的CVF

讨 论

本研究评估了高血压早期的不同阶段的应力和应变率特点，并在病理水平观测左心室心肌纤维化的程度。笔者发现RS、LS、CSRE和LSRE值是随高血压的进展而减低的，CVF、ECV的值是明显增加的，然而在高血压早期左心室射血分数等心功能参数和LGE没有明显的变化，说明在尚未出现心功能明显变化及心肌明显损伤的高血压早期，心肌应变和ECV已有明显的改变。及时监测心肌应变的变化对高血压早期患者的干预和心脏结构监测有重要的意义。

本课题组先前的一个临床研究前瞻性地对连续134例高血压患者进行了ECV测量，以确定CMR定量的ECV是否能显示左心室结构异常[7]。结果表明，LGE阴性的高血压早期患者的左心室结构异常可被ECV定量识别。本文进一步研究了高血压早期心肌应变的动态变化，并且在病理上证实了ECV的动态升高与心肌细胞外间质纤维化增重的程度一致，说明ECV可以早期、敏感监测心肌细胞间质内纤维化，从而揭示高血压早期的心肌细胞外间质增多是除心脏细胞肥大及肌小节增加的心肌肥厚的另一个重要原因。另外本研究发现RS、CSRE、LSRE的减小与ECV的增加有相关性，揭示了在高血压早期，心脏收缩功能可能因心肌纤维化的出现而减低，心肌应变可以早期敏感地反映心脏功能的改变。

EF是一项广泛应用于不同心脏疾病分期的指标，在判断预后、风险分层和选择治疗方案等方面发挥作用，既往一致认为EF正常的高血压性心脏病的心功能异常体现在舒张功能异常[14]，然而EF是反应心室的容积变化，并不是心肌的实际运动特质，而且易受瓣膜反流、心率等因素的干扰。有新研究表明，如果使用足够敏感的检测方法，许多EF正常的高血压患者的心肌收缩功能实际上存在可检测到的异常[15]。CMR-FT通过追踪心肌各节段的位置变化得到该节段心肌的各种应力和应变率，能更准确地反映心肌本身的运动并评价心肌在三维空间运动特征，从而更好地评价左心室功能。

之前有研究表明，高血压患者纵向收缩应力的减低与胶原的更新和心肌纤维化程度的增加有关[16]，在本研究中，发现应变率(代表按距离标准化后的心肌速度)也有较明显的组间差异。这与Narayanan等[17]的研究一致，他们使用超声斑点追踪的方法对动脉性高血压轻度左心室肥厚的患者进行研究，发现组织多普勒成像测量的心肌收缩速度降低，而二维斑点应力成像测量的应力值仍然在正常范围内，说明与左心室肥厚患者的应力相比，应变率是监测心肌功能障碍的更敏感的指标。考虑到CMR相对于超声心动图的优势，即不受邻近骨骼或空气的干扰，对操作员的依赖性较小，CMR的测量可提供更为准确的结果。目前心脏护理的重点是早期发现和早期开始治疗，以减少心肌功能障碍的发生[18]，应将CMR的应力和应变率参数结合起来监测心脏的收缩和舒张功能改变。

综上所述，高血压早期有心肌细胞外间质纤维化的出现，并且随着高血压的进展而加重，在常规CMR心功能检查无明显异常改变时，CMR-FT已经可以检测到左心室纵向、径向应力和周向、纵向舒张早期径向应变率有所减低。ECV和心肌应变能敏感地反映继发于高血压的左心室结构变化和功能性改变，为早期发现高血压心脏改变提供依据，从而防止疾病进程，改善远期生存质量。