木本植物内生真菌多样性的研究进展

赵鹏　王天骄　侯效阳　刘姣妹　柴新义

摘 要：为了解近年来木本植物内生真菌多样性的最新研究进展，该文从木本植物内生真菌的物种多样性、遗传多样性、代谢产物多样性和生态多样性等方面进行了文献资料查阅和概括总结，分析了研究中存在的不足，展望了未來的研究趋向，以期为深入研究内生真菌多样性提供参考。

关键词：内生真菌;木本植物;多样性

中图分类号 Q949文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）13-0102-04

Abstract： In order to understand the latest research progress on the diversity of endophytic fungi in woody plants in recent years， a literature review and review of species diversity， genetic diversity， metabolite diversity， and ecological diversity of woody plant endophytic fungi were conducted. Summarize and aim at the shortcomings in the research， and look forward to future research trends， in order to provide important reference materials for further understanding of endophytic fungal diversity and further research.

Key words： Endophytic fungi; Woody plants; Diversity

植物内生菌是指存在于植物整个或部分生活史中，且寄居于其各个健康组织和器官的内部，但不会导致植物出现明显病害症状的真菌[1-2]。近年来，越来越多的学者热衷于研究比较狭义的植物内生真菌[3]，即不引起植物明显病害症状的真菌。植物内生真菌菌群是一个巨大的天然资源宝库，且具有特殊性，普遍存在于各种植物中。尽管有关植物内生真菌的研究可追溯到百年之前，然而直到1993年Stierle等才分离到1株来自短叶红豆杉中且可以产生紫杉醇的内生真菌[4]。此后，人们关于植物内生真菌的研究才如火如荼地开展起来。

1 木本植物内生真菌多样性研究

1.1 物种多样性 植物内生真菌资源十分丰富，菌群种类繁多，提供了极为丰富的物种多样性资源。研究表明，大部分植物体内都含有1种或者多种内生真菌[5]，在不同的宿主植物中内生真菌的物种组成丰富，且存在一定差异。王立祥等分别从樟子松、红松、红皮云杉等4种健康针叶树干中各分离出9属13种、7属13种、8属17种、15属20种内生真菌，物种多样性较为丰富[6]。卢东升等通过对梅花内生真菌进行研究，共分离内生真菌15种，含有产孢真菌8属12种，未产孢真菌3种[7]。宋海燕等在4个地区的棉花样本中共分离79个菌株，归为链格孢属（Alternaria）、毛球腔菌属（Setosphaeria）、镰刀菌属（Fusarium）等共计16个属[8]。Salgado-Salazar从10种不同品种的玫瑰（Rosarugosa）健康叶片中分离92株内生真菌，其中41种为未产孢菌群，31种确定具体种类，显示出其内生真菌的物种多样性[9]。Naiketal对15种药用灌木的内生真菌多样性进行了研究，结果表明，子囊菌占8.6%、Mucoromycotina菌群占0.3%、腔孢类占26.0%、丝孢类占28%，未产孢菌群占4.9%[10]。单体江等对木麻黄枝条和果实的内生真菌研究表明，内生真菌主要为Pseudofusicoccum、曲霉属（Aspergillus）、拟茎点霉属（Phomopsis）等9个不同的属中[11]。李梦歌等将形态学和 ITS序列分析的方法有机结合，从核桃中分离内生真菌798株，隶属于38个属[12]。柴新义等对青檀果内生真菌菌群的组成及多样性进行分析，结果表明，分离自500个组织块中的共计428株内生真菌株，通过形态学鉴定的方法，确定其隶属于3目4科20属[13]，显示青檀果内生真菌物种组成的多样性。在不同树龄、不同组织部位的同种的植物宿主中，其内生真菌的物种组成亦存在明显异同。杨琴等人对不同树龄的银杏叶片内生真菌组成的研究中发现，在门水平上，其内生真菌有子囊门（Ascomycota）和接合菌门（Zygomycota）以及较少未知真菌，而在属水平上，共包含129个已知属，其中15个属平均相对丰度均大于1%，显示了其内生真菌物种组成的多样性[14]。张祖姣等通过对湖南永州桐子坳的银杏根和叶中内生真菌进行分离纯化鉴定，共计分离出80株内生真菌[15]。

1.2 遗传多样性 遗传多样性是对生物进行抗性分化研究以及相关功能菌株筛选的基础[16]。宿主内的同一内生真菌的不同菌株所产生的次生代谢成分并不完全相同，就存在宿主与内生真菌进行遗传物质的交换的可能性，从而导致它们出现遗传性状的多样性。对于木本植物，任娜通过相关序列扩增多态性（SRAP）分子标记技术对20株红豆杉的内生真菌菌株进行遗传多样性分析，结果显示：当以不同相似系数为阈值时，SRAP标记可将20株内生真菌菌划分为不同的种，表明红豆杉内生真菌具有丰富的遗传多样性[17]。郑有坤等针对源自四川汉源铅锌地区的6种常见植物上27株供试菌株进行了遗传多样性探究，结果表明，27株供试菌株被分为8个遗传群，且分别隶属分布于镰刀菌属（Fusariun），青霉属（Penicillium）等8个发育系统分支，这表明植物内生真菌存在一定的遗传多样性[18]。徐焰平通过ISSR分析法对分离得到的25个茶树芒果球座菌（Guignardia mangiferae）进行研究，结果显示其在山茶中有更丰富的遗传多样性[19]。叶静等通过对三尖杉的根、茎、叶中分离的91株真菌的ITS序列进行RFLP，结果表明三尖杉内生真菌有着丰富的遗传多样性[20]。周松林等通过RAPD技术对银杏内生真菌刺盘孢的遗传分化进行探究，结果表明，银杏内生真菌刺盘孢内部存在一定的多样性[21]。任丹等借助PCR技术对分离自川楝（Melia toosendan）中的内生真菌进行了研究，结果表明，川楝（Melia toosendan）中内生真菌的遗传多样性较高[22]。

上述研究表明，植物的内生真菌菌群在遗传上具有丰富的多样性。但就目前研究的深度和广度来看还有待于继续探索，即有关内生真菌的研究多以其离分离和鉴定以及它们对植物的有利影响为切入点，并对内生真菌的活性代谢产物进行了系列研究，而在内生真菌遗传多样性这方面的研究还略显单薄，且研究涉及的宿主植株种类有限。而遗传多样性的研究具有十分重要的意义，是研究生物的抗性分化、进行相关功能菌株筛选的基础;对于挖掘相关功能菌株、揭示内生真菌遗传进化及其与宿主植物间的关系也有着重要意义。

1.3 代谢产物多样性 次生代谢产物是在次生代谢中产生的一类对细胞生命活动和植物生长发育繁殖正常运行非必需的小分子有机化合物。协同演化理论表明，在长期的协同共生中，内生真菌与其宿主植物会相互影响，分泌产物存在一定的共性，其原因是内生真菌有非常大的可能具有与宿主植物类似的代谢途径。据报道，在内生真菌与宿主协同进化过程中，由于内生真菌与寄主植物发生了基因重组，内生真菌获取了产生和宿主植物相同的代谢产物的能力[23]。研究发现，我国有10000余种药用植物[24]，如果对其进行分析推测按照协同演化理论，内生真菌的次级代谢物质与寄主植物所产生的代谢物质在极大程度上是种类相同的，再考虑到自身原来具有的产物，可能其次生代谢物质种类更加丰富，根据以上内容可以看到内生真菌次生代谢产物具有广泛的多样性，潜在应用价值也十分的广阔，如此丰富的次级代谢种类无疑是一座巨大的资源宝库，吸引着无数的专家学者的研究兴趣。郑红梅等在植物内生真菌的研究和探索中发现，其次生代谢产物十分丰富，以药用植物内生真菌更为突出，包括有苯丙素类、萜类、生物碱类等多种化合物[25]。Josephb等的研究成果也证实了这一点，内生真菌能合成黄酮、生物碱类等多种化合物，且其中大多数化合物具有抗菌、抗癌、生物防治等多种活性[26]。苗翠萍等通过实验利用柱色谱层析方法和化性质及波谱数据分析法从滇牡丹菌株的发酵产物中分离并鉴定出了7-羟基4，6二甲基苯酞等5种化合物[27]。冯昭等通过化学与生物学活性综合的方式对海莲内生真菌进行筛选、纯化和鉴定，提取得到了3β-（E）-feruloy11upeo、stig-mastan-3-one等共计4种化合物[28]。甘琪等对福建漳州红树林植物内生真菌Stachybotrys chartarum HDN16-358进行30L的大规模培养，在此基础上对其次级代谢产物进行纯化鉴定，得到 （2S）-5-Hydroxy-2， 7-dimethyl-2-（4，8-dimethyh-3E，7-nonadienyl ）-2H-chromene-6-carbaldehyde等5种化合物[29]。

综上，植物内生真菌除了产生与其宿主代谢产物相似的物质外，还有自身合成的次级代谢产物，从而决定了植物的内生真菌的代谢产物种类具有极大的多样性。此外，次级代谢产物大多具有医药价值，具有潜在的开采和利用价值。

1.4 生态多样性 内生真菌在植物分布广泛、种类繁多，且其多样性受到宿主植物自身生理生化特性、气候条件、地理位置、温度、湿度、海拔高度等生态素的影响[30-32]。Carroll指出森林生态系统多因素的作用会影响到林木内生真菌组成和定殖率。定殖于高大、高密度且封闭均质的树冠上的内生真菌的菌种丰度一般较矮小、开放、稀松的树冠上的高[33]。其他环境因子也会不同程度地影响内生真菌菌群的多样性，如周边其他植物类群及环境状况等[34]。

不同生长年限的植物、植物的不同组织部位对于内生真菌在植物体内的生态分布都具有一定的影响，这可能与不同营养物质及量在植物体内的积累与时间及部位有关。Taylor通过比较山棕不同组织部位内生真菌的定殖情况，结果发现，老的组织中内生真菌的定殖率要比嫩的组织高，且成熟组织和幼嫩组织菌种组成不完全相同[35]。Rodrigues研究发现，巴西莓（Euterpe oleracea）中内生真菌在不同组织部位具有不同的优势菌种，其推测可能由于环境对内生真菌的选择所致[36]。

不同的植物种类、地区、季节、组织部位其内生真菌的定殖状况也各不相同。这可能与宿主生物学特性、地区生态环境因素及营养物质在组织中的积累情况等有关。Rodrigues以巴西亚马孙流域的10株蔬食埃塔棕（Euterpe oleracea）叶片为研究对象，发现内生真菌的定殖率在21%～30%[36]。Fisheretal对英格兰、西班牙等地采集得到的冬青櫟（Quercus ilex）的叶片和枝条进行了内身内生真菌的组成比较，根据实验结果得出了叶片和枝条的优势真菌明显不同的结论[37]。

研究表明，不同生境下，即便对于同种植株而言，其内生真菌菌群组成也有差异[38]。谯利军等从贵州省3个地区采集的马比木（Nothapodytes pittosporoides）样本在不同季分离出的内生真菌比较结果发现其内生真菌在季节的分布上是有所差异的[39]。宋海燕等的研究得出济阳、茌平、曹县、郓城4个地区棉叶的内生真菌优势属均为链格孢属（Alternaria），而不同地区棉花茎、铃的内生真菌优势属不同，表现出了内生真菌的生态多样性[40]。阿依佳玛丽·依玛尔等通过对来自陕西山阳县、蓝田县等3个不同生态环境下的核桃（Juglans regia）内生真菌进行研究，结果表明，不同生境或同一生境的不同组织部位的内生真菌的菌种组成均存在差异，表明内生真菌菌种组成存在生态多样性[41]。毛光瑞等通过对陕西省核桃（Juglans regia）主产区的核桃的内生真菌进行纯化鉴定，结果表明，不同生境、不同季节的核桃内生真菌的分离频率存在差异[42]，因此核桃的内生真菌具有生态多样性。张婷等以湖北省5个采集地的油茶样品为研究对象，对其内生真菌进行研究，结果表明：内生真菌菌群组成及多样性在不同组织部位的分布存在差异，以叶分离的最多，其次是茎，根最少;内生真菌在不同地理位置的分布也存在一定的特征;在不同季节分离出的内生真菌的分离率存在差异[43]。以上均体现出了内生真菌的生态多样性。

综上所述，不同的宿主或同一宿主的不同组合部位、不同的环境因子等一系列不同的生态条件下，植物的内生真菌菌群组成都具有不同程度的差异性，从而体现出木本植物内生真菌的生态多样性。

2 存在问题

近年来，国内外学者在植物内生真菌及其次生代谢产物的多样性研究方面已取得了重大进展，为植物内生真菌资源在农业和医药等领域的开发与利用奠定了良好的前期基础。尽管如此，其中也发现不少问题，主要表现在以下几个方面：（1）可能内生真菌对所定殖的宿主内某些天然成分的需求是人工培养基所不具备的，因而在进行分离的过程中，采用多种培养基培养也无法保证所有生活在植物内的真菌全部被分离出来，无疑这对菌群组成的鉴定结果产生了一定的影响。（2）不同的种类的真菌，其生长速率往往存在着较大的差异，即使在分离培养基中加入了抑制真菌快速过度繁殖的药剂，仍然存在着生长缓慢的真菌被快速生长的真菌覆盖，从而影响研究结果;（3）关于内生真菌的鉴定也存在一些难题，因部分真菌在人工培养基上不产生孢子，且占据的比例相对较高，而这些不产生孢菌株是无法用经典方法进行鉴定;（4）采用的鉴定方法较为单一，多以传统形态学鉴定法为主，较少运用分子生物学技术手段;（5）对木本植物内生真菌研究的广度和深度，明显不及草本植物，尤其体现在木本植物的遗传多样性的研究上。另外，目前的研究也多集中在药用植物内生真菌以及内生真菌次级代谢产物上，而对于传统作物和特有的古老植物种类的研究仍相对较少。

3 展望

对内生真菌资源宝库的勘探对于人类生产和生活以及探究自然是十分有利的。目前的研究成果已经可以充分证明，每一株植物都是内生真菌资源宝库的载体，蕴含着极大的内生真菌多样性。与植物内生真菌有关的许多领域都值得进行更深一步的探索和研究，如内生真菌对其宿主植物组织专一性定殖的机理，内生真菌对植物抗逆性的提高和生物防治的作用机理，以及如何在充分发挥植物内生真菌优良特性的基础上避免其产生的不良影响等，对于传统古老特有木本植物内生真菌菌群多样性的研究有待于深入开展。

参考文献

[1]Orlando Petrini. Fungal Endophytes of Tree Leaves[M]. Springer New York，1991.

[2]CARROLL G. Fungal endophytes in stems and leaves：from latent pathogen to mutualistic symbiont[J]. Ecology，1988，69（1）：2.

[3]唐雪辉，毛凯，干友民，等.植物内生真菌的应用研究概况[J].草原与草坪，2005（5）：18-23

[4]STIERLE A，STROBEL G，STIERLE D. Taxol and taxane production by Taxomycesandreanae，an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science，1993，260（5105）：214-216.

[5]Tan RX，Zou WX. Endophytes：a rich source of functional metabolites[J]. Nat Prod Rep，2001，18：448-459.

[6]王立祥，刘晓博，任利利，等.松树蜂入侵的混交林中针叶树种内生真菌多样性[J].林业科学，2017，53（9）：81-89.

[7]卢东升，侯志杰，王婷敏.梅花内生真菌及其多样性[J].东北林业大学学报，2017，45（1）：86-89.

[8]宋海燕，李丽莉，李超，等.棉花不同部位内生真菌群落结构及多样性分析[J].中国棉花，2019，46（1）：20-25.

[9]Salgado-Salazar C，María Caridad Cepero de Garcia. Endophytic fungi in rose （Rosa hybrida） in Bogota，Colombia[J]. Revista Iberoamericana de Micología，2005，22（2）：99-101.

[10]Naik S，Shashikala J，Krishnamurthy YL. Diversity of fungal endophytes in shrubby medicinal plants of Malnad region，Western Ghats，Southern India[5].Fungal Ecology，2008，01：89-93.

[11]单体江，秦楷，谢银燕，等.木麻黄内生真菌次生代谢产物及生物活性[J].华南农业大学学报，2019，40（3）：67-74.

[12]李梦歌，惠建超，阿依佳玛丽·依玛尔，等.陕西宜君核桃内生真菌多样性研究[J].云南农业大学学报（自然科学），2018，33（5）：818-825.

[13]柴新义，钟媛媛.青檀果内生真菌菌群的组成及多样性[J].应用生态学报，2017，28（2）：636-642.

[14]杨琴，邹凯，陈爱佳，等.不同树龄银杏叶内生真菌的多样性及群落结构分析[J].湖南农业大学学报（自然科学版），2019，45（1）：42-49.

[15]文传浩，段昌群，常学秀，等.重金属污染下曼陀罗种群分化的RAPD分析[J].生态学报，2001（08）：1239-1245.

[16]张祖姣，袁志辉，赵子豪，等.抗姜青枯菌银杏内生真菌的分离及抑菌特性[J].中国生物防治学报，2018，34（6）：890-896.

[17]黄东益.旗草内生真菌的遗传多樣性分析[J].热带作物学报，2008，29（6）：793-798.

[18]任娜.红豆杉内生真菌遗传多样性分析及生物转化研究[D].长沙：中南大学，2011.

[19]郑有坤，陈诚，任丹，等.四川汉源铅锌矿区植物内生真菌的遗传多样性初步研究[J].四川农业大学学报，2013，31（03）：308-313.

[20]徐焰平.茶树内生芒果球座菌（Guignardia mangiferae）的鉴定、生态分布和遗传多样性分析[D].福州：福建师范大学，2009.

[21]叶静，冉雪琴，孙端方，等.三尖杉内生真菌的遗传多样性研究[J].山地农业生物学报，2009，28（2）：130-135.

[22]周松林.银杏内生真菌刺盘孢遗传多样性的初步分析[A]//中国植物病理学会.2005年中南、西南植物病理学会和中国菌物学会联合学术年会论文集[C].中国植物病理学会：中国植物病理学会，2005：2.

[23]任丹，张波，张小平，等.川楝内生真菌的遗传及PKS、NRPS基因的多样性[J].中草药，2014，45（10）：1461-1467.

[24]邹文欣，谭仁祥.植物科学研究进展[M].2版.北京：高等教育出版社，1999.

[25]张惠源，赵润怀，袁昌齐，等.我国的中药资源种类[J].中国中药杂志，1995，20（7）：387-390.

[26]郑红梅，叶耀辉，王婷，等.药用植物内生真菌及其代谢产物活性的研究概况[J].江西中医药，2016，47（4）：71-73.

[27]Baby Joseph and R. Mini Priya. Bioactive compounds from endophytes and their potential in pharmaceutical effect：A Review. American Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2011，1：291-309.

[28]苗翠苹，胡娟，翟英哲，等.滇牡丹内生真菌PR20的鉴定及次生代谢产物的研究[J].天然产物研究与开发，2012，24（10）：1339-1342.

[29]冯昭，张旭，徐静.红树林植物海莲内生真菌活性菌株筛选及次级代谢产物研究[J].华中农业大学学报，2019，38（06）：86-91.

[30]甘琪，徐旭，张晓敏，等.红树林植物内生真菌Stachybotrys chartarum HDN16-358次级代谢产物研究[J].中国海洋药物，2019，38（4）：48-52.

[31]Stone J K，Bacon C W，White J. An overview of endo-phytic microbes：endophytism defined[J]. Microbial endophytes，2000，3：29-33.

[32]Hoffman M T，Arnold A E. Geographic locality and host identity shape fungal endophyte communities in cupressaceous trees[J]. Mycological Research，2008，112（3）：331-344.

[33]Carroll G.FOREST endophytes-pattern and process[J]. Canadian journal of botany，1995，73（suppl 1 e-h）：S1316-S1324.

[34]Helander M. Simulated acid rain affects birch leaf endophyte populations[J]. Microb Ecol，1993，26（3）：227-234.

[35]Taylor J E，Hyde K D，Jones E B G. Endophytic fungi associated with the temperate palm， Trachycarpus fortunei，within and outside its natural geographic range[J]. New Phytologist，1999，142（2）：335-346.

[36]Rodrigues K F. The foliar fungal endophytes of the Amazon palm Euterpe oleracea[J]. Mycologia，1994，86：376-385.

[37]Fisher P J. Survival and Spread of the Endophyte Stagonospora pteridiicola in Pteridium aquilinum，Other Ferns and Some Flowering Plants[J]. New Phytologist，1996，132（1）：119-122.

[38]陳言柳，裴男才，吴斐，等.不同地区油茶内生真菌多样性及其抑菌活性[J].生物灾害科学，2018，41（4）：261-267.

[39]谯利军，周思旋，文庭池，等.贵州马比木内生真菌的多样性研究[J].菌物学报，2018，37（1）：43-51.

[40]宋海燕，李丽莉，李超，等.棉花不同部位内生真菌群落结构及多样性分析[J].中国棉花，2019，46（1）：20-25.

[41]阿依佳玛丽·依玛尔，刘泽星，毛光瑞，等.不同生境春季核桃内生真菌分离及其多样性[J].西北林学院学报，2016，31（6）：184-189.

[42]毛光瑞，翟梅枝，史冠昭，等.陕西不同生境核桃内生真菌多样性[J].微生物学通报，2016，43（6）：1262-1273.

[43]张婷，左雪枝，徐艳.油茶内生真菌多样性与抑菌性研究[J].河南农业科学，2017，46（4）：68-74.

（责编：张宏民）