基于SPME-GC-MS和电子鼻的鱼粉挥发性物质分析

李 培 牛智有,2 朱 明,2 邵恺怿 耿 婕 李洪成

(1.华中农业大学工学院， 武汉 430070； 2.农业农村部长江中下游农业装备重点实验室， 武汉 430070)

0 引言

鱼粉是以一种或多种鱼类为原料，经去油、脱水、粉碎加工后蛋白质含量较高的饲料原料。近几年，随着我国水产养殖规模的增大，水产饲料需求量快速增长，对鱼粉的需求量也呈持续高增长趋势[1]。鱼粉是一种重要的饲料蛋白质来源，其品质直接影响饲料产品的质量[2]。在运输、贮藏过程中，由于温度、湿度等的影响，鱼粉会发生蛋白质-脂类的共价相互作用，造成营养成分的大量流失，并生成有害物质，这不仅会危害动物健康，也会对人类的健康构成威胁[3]，因此对鱼粉新鲜度的检测尤为重要。挥发性盐基氮(Total volatile basic nitrogen，TVB-N)含量和酸价(Acid values, AV)是评价鱼粉新鲜度的主要指标，但其测量方法耗时、耗力。鱼粉品质变化与鱼粉所挥发出来的气味有很大的关系。新鲜的优质鱼粉气味纯正，存放过久、受潮腐败的鱼粉常有腥臭味、哈喇味和刺鼻的氨味，研究鱼粉挥发气味对判断鱼粉的品质具有重要作用。

近年来，电子鼻和气相色谱质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技术已经广泛应用于食品、医学等领域[4-10]。两者的结合能够实现鱼粉新鲜度的全面分析，但目前鲜有对挥发性物质含量快速检测的研究报道。

为了能够全面、快速分析鱼粉的新鲜度，本文将电子鼻与顶空固相微萃取气质联用技术结合，以挥发性物质含量辅助评价鱼粉的新鲜度。首先，通过顶空固相微萃取气质联用技术得到不同新鲜度鱼粉的挥发性物质含量和种类，以研究不同新鲜度鱼粉挥发性物质的变化机理；然后，在所研制的电子鼻的基础上，依据传感器响应采用多元线性回归(Multiple linear regression, MLR)和最近邻回归(K-nearest neighbor, KNN)方法对鱼粉的挥发性物质建立预测模型。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集4种新鲜鱼粉(其中3种进口鱼粉，分别来自秘鲁、美国和俄罗斯，1种国产鱼粉)放置于温度35℃、相对湿度80%的恒温恒湿人工气候箱中，使鱼粉随着储藏时间的延长逐渐腐败变质，在储藏的过程中每隔一段时间对不同储藏时间的鱼粉样本进行采集并作为试验样本，共采集了18种储藏时间等级的鱼粉，用于挥发性气体成分检测。并将这18个不同新鲜度鱼粉样本进行编号，记为1～18(新鲜度随样本编号的增大越来越差)。

1.2 试验仪器

DF101-S型恒温磁力式搅拌器(巩义泰洪升仪器厂)；DSQ-Ⅱ型气质联用仪(美国赛默飞公司)；萃取纤维头(2 cm-50/30μm DVB/CAR/PDMS StableFlex，美国Supelco 公司)；20 mL螺口透明圆底顶空瓶(美国Agilent公司)；氯化钠(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)；正构烷烃(C7～C40，美国AccuStandard公司)。RGX-250B型人工气候箱(上海坤天仪器有限公司)；自行研制的基于仿生嗅觉的鱼粉新鲜度检测装置，如图1(图中实线表示气路，虚线表示电路)所示。该装置主要由气体采集与传输模块、以树莓派为核心的控制处理存储模块、ARPI600数据采集模块、传感器阵列模块组成。传感器阵列模块为该装置的核心部件，主要由10个气体传感器组成，即传感器1～10，各传感器所能检测的目标气体如表1所示。

表1 气体传感器所测量的目标气体以及检测范围Tab.1 Target gas measured by gas sensors and detection range

图1 电子鼻的系统组成框图Fig.1 Block diagram of detection device system

1.3 理化指标测定

酸价测定方法：采用GB/T 19164—2003方法测定[11]。挥发性盐基氮含量测定方法：采用GB/T 5009.228—2016中的自动凯氏定氮仪法测定[12]。

1.4 电子鼻数据采集

测试时，首先对该检测装置进行预热，再经活性炭过滤之后的纯净空气对装置进行清洗，经试验优化得到清洗时间为77 s；然后将80 g鱼粉样本置于250 mL的高硼硅采样瓶中，由微型气泵将样本产生的顶空气体抽至检测装置的气体采样室中，与位于采样室中的气体传感器发生化学反应，进而引起传感器的阻值发生变化，泵的流速为2.2 L/min。经试验优化得到该装置的检测时间为39 s，数据采样间隔为1 s。最后每次采样完之后对装置进行清洗复原，进行下一个样本的测试。

在储藏的过程中采集了18个不同储藏时间等级的鱼粉作为试验样本，同一储藏时间的样品平行测试11次，共进行198次电子鼻测试试验。

1.5 GC-MS检测

1.5.1顶空固相微萃取

准确称取样品3 g于20 mL顶空瓶中，加入4 mL饱和NaCl溶液，将其放入恒温磁力搅拌器中67℃平衡10 min，然后将已老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS型萃取头插入顶空瓶中于67℃萃取40 min后拔出，再插入到GC进样口，解吸5 min，拔出，每个样品重复测试3次。

1.5.2检测条件

色谱柱：TG-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；载气为氦气，流速1 mL/min；升温程序：柱初温40℃，保持5 min，以4℃/min升至120℃，保持1 min，再以13℃/min升至250℃，保持5 min；进样口温度250℃，分流进样，分流比为5∶1。

质谱条件：传输线温度280℃；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；电子离子源；电子能量70 eV；溶剂延迟1 min；全扫描方式；质量扫描范围50～500(质荷比)。

1.5.3挥发性物质定性及定量分析

利用随机Xcalibur工作站NIST2014标准谱库进行挥发性成分定性分析，通过将化合物的质谱和保留时间与注入的真实标准(C7～C40)的质谱和保留时间进行比较来鉴定化合物，根据挥发物的保留时间计算保留指数(Retention index, RI)，计算公式为[13]

(1)

其中

TRn

式中Ri——保留指数

TRx——待测组分的保留时间，min

n——正构烷烃的碳原子数

采用峰面积归一化法计算各挥发性化合物的相对含量。

2 结果与分析

2.1 不同新鲜度鱼粉的理化指标检测结果

不同新鲜度鱼粉中挥发性盐基氮含量(质量比)和酸价如表2所示。从表2可以看出，鱼粉在高温高湿条件下储藏的过程中，随着储藏时间的增加(储藏时间随样本编号的增大而增加)，鱼粉中挥发性盐基氮含量呈现增加的趋势，表明鱼粉随着储藏时间的增加而逐步变质腐败。酸价变化规律不明显。

表2 不同新鲜度鱼粉的理化指标检测结果Tab.2 Test results of physical and chemical indexes of fish meal with different freshness

2.2 电子鼻检测

电子鼻可以敏感获取样品的气味信息，挥发性化合物的微小变化可能导致传感器响应的差异。本文以归一化后的传感器响应信号相对稳定状态均值为研究对象，选取了5种不同新鲜度的鱼粉样本(分别对应表2中样本编号为4、7、11、14、17的样本)，得到了相对应的指纹图谱，如图2所示。图2显示了5种新鲜度鱼粉样本之间的明显差异，样本17 的传感器信号强度显著高于其他新鲜度鱼粉的传感器信号强度，样本7、样本11和样本14在一些传感器上的响应较为相似，表明在样品中存在相似的挥发性成分；因此雷达图可以作为一种简单的统计工具，可以有效区分不同新鲜度鱼粉的挥发性成分。

图2 不同新鲜度鱼粉电子鼻的指纹图谱Fig.2 Fingerprints of detection system with different freshness fish meal

2.3 不同新鲜度鱼粉挥发性物质的GC-MS测定

采用SPME-GC-MS方法，对18个不同储藏时间的鱼粉所挥发出来的物质进行检测，共检测和鉴定出醇类、醛类、酸类、烃类、酮类、含硫、含氮、酯类、酚类、醚类和其他类化合物11类，共计101种。不同新鲜度鱼粉的挥发性物质含量存在显著差异，通过挥发性物质来鉴别不同新鲜度等级的鱼粉是一个很好的方法。由于制作鱼粉的原料为各种鱼类，所以不同储藏时间鱼粉所挥发出来的物质与鱼类挥发出来的物质比较相似。

图3a为不同储藏时间等级鱼粉的各类挥发性物质相对含量。从图中可以看出，醛类化合物相对含量显著降低，酮类化合物相对含量则有所上升，醇类化合物、烃类化合物、酯类化合物、酚类化合物在储藏过程中相对含量呈先上升后下降的趋势，酸类化合物、含氮化合物、含硫化合物、醚类化合物相对含量则呈现上升趋势。图3b为不同储藏时间等级鱼粉挥发性物质种类花瓣韦恩图。从图中可以看出，18个不同新鲜度鱼粉样本分别鉴定出挥发性物质39、45、44、41、35、28、39、31、38、33、33、35、38、31、34、29、34、35种，这些鱼粉样本的共同挥发性物质有6种，分别为壬醛、癸醛、十二烷、十四烷、萘和苯乙酮。由于在储藏的过程中受到微生物、光照等的影响，会发生脂肪氧化、蛋白质水解等现象，因此会出现旧物质的消失和新物质的生成，所以18个不同新鲜度的鱼粉所共有的挥发性物质较少。图4为不同储藏时间等级鱼粉各类挥发性物质种类数量的比较结果。从图中可以看出，在储藏的过程中，醛酮类化合物的种类数量较多，酯类、酚类、醚类化合物种类数量则较少，说明醛酮类化合物在鱼粉的挥发性物质中有着重要的作用。

图4 不同储藏时间等级鱼粉各类挥发性物质种类数量Fig.4 Numbers of various volatile compounds in fish meal with different storage time levels

图3 不同储藏时间等级鱼粉中各类挥发性物质相对含量和种类Fig.3 Relative content and types of all kinds of volatile components in fish meal at different storage time levels

2.4 挥发性物质分析

2.4.1醇类化合物

GC-MS鉴定出来的醇类化合物有11种，且醇类化合物在储藏过程中相对含量为先上升后下降趋势。在这些醇类化合物中，苯甲醇、1-庚醇、2-辛炔-1-醇、1-己烯-3-醇、2-乙基-1-己醇、1-辛烯-3-醇仅在储藏初期出现，而3-甲基-1-丁醇则在储藏后期生成。1-辛烯-3-醇被报道广泛存在于鱼类中，挥发性气味浓郁，产生于亚油酸的氢过氧化物降解作用[14]。3-甲基-1-丁醇与微生物的活性有关，被认为是评价鱼类在储藏期间腐败或失去新鲜度的一个指标。(Z)-2-戊烯-1-醇在储藏的过程中逐渐减少，文献[15]报道(Z)-2-戊烯-1-醇、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇可以被用来作为鲑鱼新鲜度的潜在标记物。

2.4.2醛酮类化合物

醛酮类化合物在储藏的过程中相对含量较高，且阈值较低，对风味贡献较大[16]，且在不同储藏时间等级的鱼粉中相对含量较高。在鱼粉储藏的过程中共检测到醛类化合物20种，酮类化合物26种。醛酮类化合物主要由不饱和脂肪酸的氧化、氨基酸的降解以及美拉德反应或微生物的氧化生成[3]。其中，壬醛、癸醛在储藏的过程中始终存在，这与文献[17]在大菱鲆挥发性物质检测中的结果一致。一些醛类化合物被认为是新鲜鱼类的主要挥发性物质，在储藏初期，醛类化合物相对含量为48.99%，但在储藏末期鱼粉中相对含量为0.95%，醛类化合物显著降低，这与文献[18]对三文鱼片冷藏过程中挥发性成分的变化一致；醛类化合物相对含量显著下降，主要是微生物和内源酶的作用引起。新鲜鱼粉挥发性物质特征包含了由多不饱和脂肪酸氧合酶作用产生的6、8、9个碳原子的醛类化合物[15]。己醛是鱼类特有的甜味剂的一个重要贡献者，据报道，其主要是由鱼肉中最丰富的脂肪酸亚油酸氧化形成的[19]，己醛在储藏前期存在，在储藏后期检测不到。庚醛主要由n-6多不饱和脂肪酸氧化形成[20]，其也在储藏前期存在，在储藏后期检测不到，而壬醛则来自于n-9多不饱和脂肪酸的氧化作用[21]，在储藏过程中相对含量降低。3-甲基丁醛的产生与Strecker降解和微生物对亮氨酸和异亮氨酸的活性有关[22]，苯乙醛的产生与苯丙氨酸有关，并在熏鱼中检测到[23]，这两种物质都是在储藏初期含量较高，在储藏后期含量下降甚至消失。酮类挥发性物质相对含量则有所上升，储藏初期鱼粉中酮类化合物相对含量为28.55%，但在储藏末期鱼粉中则为51.43%，增加了近50%。含量较高的(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮则在储藏后期消失。此外，2-十一烷酮、苯乙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和2-壬酮均在鱼类挥发性物质中检测到[24]。

2.4.3酸酯酚醚类化合物

酸类化合物相对含量在储藏过程中呈现上升的趋势，且共检测到8种酸类化合物。酸类物质可能来源于甘油和磷脂的降解，己酸在检测到的储藏时间等级内含量无显著性差异。辛酸和3-甲基丁酸具有奶油和油脂味，在样本3下检测到辛酸，在样本18下3-甲基丁酸消失。酯类、酚类和醚类化合物种类和含量较少，且随着储藏时间的增加，酯类、酚类化合物呈现先增加后减少的趋势，酯类化合物的增加可能是由于鱼肉中的酶和微生物新陈代谢的共同作用所致。醚类化合物只在样本7、11、13、18中出现。

2.4.4烃类化合物

鱼粉挥发性物质中共鉴定出烃类化合物9种，在储藏过程中烃类化合物相对含量呈现先上升后下降的趋势。据报道，烃类化合物由于其较高的气味阈值而对风味贡献较低。在鱼粉储藏过程中，芳香烃-萘在储藏期间表现出变异性，而且在不同鱼类中也被报道，然而其来源尚未完全阐明。萘可能来自周围环境，并在龙虾、扇贝、螃蟹中也被检测到[25]。

2.4.5含氮、含硫化合物

含氮化合物、含硫化合物相对含量均呈现上升趋势。含氮化合物主要为三甲胺、吡嗪类化合物、呋喃类化合物、吡啶类化合物等化合物，共计15种。三甲胺在储藏过程中逐渐增加，三甲胺由氧化三甲胺在细菌酶的作用下产生，呈现不好的氨味，广泛存在于海鱼等水产品中[26]，是鱼类腐败的标志物。吡嗪类化合物主要产生于α-氨基酮经美拉德反应，但也可能与微生物有关[27]，呋喃类产生于糖焦糖化和碳水化合物的降解作用；2-戊基呋喃形成主要与加热过程中的脂质氧化和降解作用有关，一般存在于熟肉和肉制品中，赋予产品烘烤味，出现这个物质的原因可能是由于鱼粉的蒸煮等加工工艺的影响。

鱼粉挥发性物质中共鉴定出含硫化合物4种，这些化合物都经历了从无到有的过程，即在特别新鲜的鱼粉样本中检测不到，但随着鱼粉品质变得不新鲜，出现了这些含硫化合物，这可能是蛋氨酸通过酵母代谢的中间产物甲硫醇进一步转化为二甲基二硫、二甲基三硫等硫化物[28]。

2.4.6其他类化合物

由于加工鱼粉所用的原料为鱼类，所以检测到的鱼粉所挥发出来的气味与鱼类所挥发出来的物质类似，但是鱼粉作为一种饲料原料，不仅只是原料鱼的简单加工，而是需要一些其他添加剂以方便鱼粉运输和储藏。因此在检测中便发现有乙氧喹和γ-脱氢酶，乙氧喹是一种性能优良的抗氧化剂，把它添加到饲料中，可有效地防止饲料中的营养成分(如脂肪、蛋白质、维生素等)受空气中氧的作用而发生变质[29]。γ-脱氢酶是一种抗氧化酶，抗氧化酶与抗氧化剂不同，一旦有过氧化物形成，它们就会立刻发挥作用，利用氧化还原反应将有毒害的过氧化物转换为低毒害甚至无毒害的物质。而在鱼粉中检测到尿素，则可能是由于部分厂家为了提高化验结果的蛋白质含量，冒充高档鱼粉，也有可能是由于微生物等作用产生的物质。

2.5 挥发性物质模型建立

由于气体传感器阵列只给出了鱼粉气味的整体信息，而GC-MS给出了鱼粉样本挥发性成分的详细信息，因此建议根据气体传感器响应来得到鱼粉样本具体挥发性成分信息[30]，以辅助评判鱼粉的新鲜度。本文选择了对于KNN分类方法来说，单个特征分类准确率较好的传感器响应信号相对稳定状态均值作为输入来分析不同种类的挥发性物质[31]。不同种类的挥发性物质以及由参考文献获得的明显表征不同储藏时间鱼粉逐渐腐败或失去新鲜度的标记物被选中进行进一步分析。多元线性回归和KNN回归算法被用于挥发性物质模型的建立。用固相微萃取-气相色谱/质谱法测定挥发性物质的相对含量，作为回归模型的参考数据。多元回归的目的是根据一组自变量(如气体传感器响应信号值)到另一组连续的因变量(如挥发性物质相对含量)建立预测模型。KNN回归算法的核心思想是对于一个新输入的数据，计算给定样本数据集中每个样本与新输入数据的距离，按照距离递增排序，通过找出一个样本的k个最近邻居，将这些邻居某个属性的平均值赋给该样本，就可以得到该样本对应属性的值，根据前期试验得到本文的k=2效果较好。利用这些回归模型，建立了检测系统的传感器响应信号值与鱼粉挥发性物质含量之间的关系。用于评估模型预测能力的参数有：实际变量与预测变量之间的相关系数(R)和均方根误差。

表3为两种预测模型的相关系数和均方根误差，图5为不同种类挥发性物质的KNN回归模型预测结果。从表3和图5中可以看出，鱼粉不同种类的挥发性物质都得到了比较好的预测结果。与MLR方法相比，KNN回归算法具有更好的预测能力，测试集相关系数在0.763 3～0.999 9之间，均方根误差在0.086 7%～8.465 5%之间。因此，利用检测系统中传感器的响应信息能够实现鱼粉挥发性物质含量的预测，也证明了检测系统适合作为GC-MS的替代方法来评价不同新鲜度等级的鱼粉。

表3 预测模型的相关系数和均方根误差Tab.3 Correlation coefficient and RMSE for prediction models

图5 不同种类挥发性物质的KNN回归模型预测结果Fig.5 Prediction results of KNN regression model of different volatile components

3 结论

(1)采用顶空固相微萃取气质联用方法对18种不同储藏时间鱼粉的挥发性物质进行了检测，共检测到101种挥发性物质，主要包括醇类、醛类化合物等11种挥发性物质，其中醛酮类化合物的种类较多。

(2)在储藏过程中，醛类化合物相对含量呈下降趋势；酮类化合物、酸类化合物、含氮化合物、含硫化合物相对含量则呈上升趋势；醇类化合物、烃类化合物、酯类化合物、酚类化合物相对含量呈先上升后下降的趋势。得到了表征鱼粉新鲜度的三甲胺、二甲基二硫、二甲基三硫等化合物。不同储藏时间的鱼粉挥发出来的物质含量具有显著差异，可通过挥发性物质来鉴别不同新鲜度的鱼粉。

(3)采用多元线性回归方法和最近邻算法(KNN)建立了鱼粉各类挥发性物质含量和表征新鲜度的标记物含量与传感器响应参数之间的回归模型。与多元线性回归方法相比，KNN回归法具有更好的预测能力，得到测试集相关系数在0.763 3～0.999 9之间，均方根误差在0.086 7%～8.465 5%之间。

(4)利用检测系统中传感器的响应信息能够实现鱼粉挥发性物质的预测，也证明检测系统适合作为GC-MS的替代方法来评价不同新鲜度的鱼粉。