低致病性与高致病性H7N9亚型禽流感病毒分子特征及受体结合能力分析

薛玉涵 任助 商雨 唐国毅 贾妙妙 鲁岳峰 李琼琼 李慧敏 罗青平 温国元 潘兹书 赵宗正

摘要：对2017年从鸡病料中分离到的2株H7N9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）A/chicken/Hubei/093/2017（H7N9）和A/chicken/Hubei/207/2017（H7N9）（CK93和CK207）进行了全基因组测序。对血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）序列保守性、HA糖基化位点、NA耐药位点和6个内部基因的关键氨基酸位点进行了分析，同时测定了2株毒株的受体结合能力。结果显示，CK93毒株HA裂解位点为PEIPKGR↓GLF，为低致病性AIV特征;而CK207毒株裂解位点为PKPKRTAR↓GLF，为高致病性AIV特征。HA第226位氨基酸在CK93毒株为亮氨酸（226L），而在CK207毒株为谷氨酰胺（226Q）。但受体结合能力测定发现，CK93和CK207都具有结合α-2，3唾液酸受体和α-2，6唾液酸受体的特性，说明Q226L并非影响病毒受体结合特性的决定性因素。本研究结果提示应加强对H7N9亚型禽流感病毒变异监测预防其突变可能造成流行的风险。

关键词：H7N9亚型禽流感病毒;分子特征分析;受体结合特性

中图分类号：S852.65 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）07-0212-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.044

Abstract： Two H7N9 subtype avian influenza viruses （AIV） isolated from chicken pathological material in Hubei Province，A/chicken/Hubei/093/2017（H7N9） and A/chicken/Hubei/207/2017（H7N9） （with CK93 and CK207 as their abbreviation，respectively） were analyzed for whole-genome sequencing. The hemagglutinin （HA） and neuraminidase （NA） sequence conservation，as well as HA glycosylation site，NA resistance site and key amino acid sites of 6 internal gene-encoded proteins were analyzed，meanwhile，the receptor binding ability of the two strains was determined as well. The results suggested that the HA protein cleavage site of CK93 was PEIPKGR↓GLF，which indicated a low pathogenicity of CK93，whereas CK207 was mutated to PKPKRTAR↓GLF，which indicated a high pathogenicity of CK207. At the same time，the 226 amino acid sequence of HA in CK93 was Leucine （226L），while its counterpart in CK207 was Glutamine （226Q）. However，the receptor binding ability results suggested that two isolates can be bound to both α-2，3 sialic acid receptor and α-2，6 sialic acid receptor，it is indicated that the Q226L is not a decisive factor affecting receptor binding characteristics. In light of the above information，it is suggested that precaution and control to the mutation of H7N9 subtype avian influenza should be enhanced in order to lower any risk of epidemic owing to its mutation.

Key words： H7N9 subtype avian influenza virus; molecular characterization analysis; receptor-binding specificities

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）為正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒属成员。病毒的基因组由8个单股负链的RNA片段组成，每个片段编码1种或2种蛋白质[1]，编码的蛋白主要包括3个聚合酶亚单位（PB2、PB1和PA），PB1-F2，PA-X，血凝素蛋白（HA），神经氨酸酶（NA），核蛋白（Nucleoprotein，NP），基质蛋白（Matrix proteins，M1）和离子通道蛋白M2，非结构蛋白质（Nonstructural proteins，NS）NS1和NEP（NS2）。基于病毒2种表面糖蛋白HA和NA的抗原差异，将A型流感病毒分为17个HA亚型（H1～H17）和10个NA亚型（N1～ N10）[2]。由于已知的所有HA和NA亚型均可在野鸟中分离到，目前普遍认为野鸟是 AIVs的天然宿主[3]。病毒主要通过点突变和基因重组的方式发生变异，导致抗原漂移和抗原转换。

依据在鸡中致病性强弱，禽流感病毒分为高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic AIV，HPAIV）和低致病性禽流感病毒（Low pathogenic AIV，LPAIV）[4]。高致病性禽流感是由部分H5和H7亚型HPAIV引起[5]。中国于2013年首次发现的H7N9亚型禽流感病毒属于LPAIV，对家禽及野鸟属于隐性感染，致病性低，但人感染后会造成重症肺炎及多器官衰竭，甚至死亡[6]。据WHO报道，截至2018年9月，已有1 567例人感染H7N9确诊病例，病死率接近40%[7]。有研究表明，H7N9病毒具备结合人类呼吸道受体特性，也保留了结合禽类呼吸道受体能力，因此能在人和禽类之间传播[8]。在雪貂模型上证实，H7N9毒株能通过呼吸道进行飞沫传播[8，9]。但流行病学还未发现H7N9病毒有人传人的直接证据。2017年在广东发现了鸡高致病性H7N9变异株[10]。H7N9亚型AIV因变异产生高致病性流行株，不仅给中国禽类养殖业造成巨大危害，也威胁着人类健康。本研究分离鉴定了1株高致病性和1株低致病性鸡源H7N9亚型禽流感病毒，并对其进行了全基因组测序分析和受体结合能力测定。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司;AIV反转录通用引物Unit12（5-AGCR AAAGCAGG-3）、AIV片段扩增通用引物M-229（上游引物：5-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3;下游引物：5-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3）由生工生物工程（上海）股份有限公司武汉分公司合成;RNA提取试剂TRIzol（Invitrogen）、HiScript反转录酶（Vazyme）、2×Phanta Max Master Mix高保真酶（Vazyme）、α-2，3-Sialidase（TaKaRa）、唾液酸酶VCNA（Roche）、无菌脱纤维绵羊血购自广州蕊特生物科技有限公司。

1.2 病毒的分离鉴定与基因组扩增

病毒分离自送检鸡的病料。经PCR检测和序列测定确定为H7N9亚型禽流感病毒，通过除菌过滤、SPF鸡胚增殖获得病毒，并保存于-80℃。病毒实验在生物安全三级实验室完成。

用TRIzol试剂从扩增病毒的鸡胚尿囊液中提取H7N9病毒RNA，溶解于20 μL的TE缓冲液中。以病毒RNA为模板，反转录引物为Unit12，反转录得到cDNA。取病毒cDNA为模板，用流感通用引物扩增8个基因片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司武汉分公司测定基因序列。

1.3 H7N9流感病毒基因序列分析

将HA、NA、PA、PB1、PB2、NS、NP和M基因序列分别登录美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）进行核苷酸序列Blast分析。从NCBI流感病毒库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/nph-select.cgi#mainform）下载H7N9流感病毒HA、NA基因序列及其编码蛋白序列。采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis 7.0（MEGA 7.0）软件进行序列比对，采用邻接法（Neighbor-joining method，NJ）构建H7N9病毒基因进化树（Bootstrap重复值为1000）。利用序列比对软件BioEdit中的ClustalW程序进行毒株核苷酸与氨基酸同源性计算。

1.4 红细胞的配制与受体结合试验

鸡血采集自健康的SPF公鸡，加入10倍体积PBS洗涤，2 000 rpm離心5 min，重复洗涤3次，收集鸡红细胞沉淀;

取鸡红细胞（chicken red blood cells，cRBCs）和绵羊红细胞（sheep red blood cells，sRBCs）用PBS配成10%的悬液，用PBS洗涤2次，1 500 rpm离心5 min。分别配置如下4种红细胞悬液：a.用PBS配制1% cRBC悬液，4 ℃下储存备用;b.用PBS配制1% sRBC悬液，4 ℃下储存备用;c.取10%的cRBC悬液90 μL，加入10 μL的α-2，3-Sialidase（50 mU/μL），在37 ℃处理10 min，用PBS配制1% 的悬液，4℃下储存备用;d.取10%的cRBC悬液90 μL，加入10 μL的VCNA（50 mU/μL），在37 ℃处理1 h，用PBS配制1% 的悬液，4 ℃下储存备用。

将50 μL病毒液在96孔V型板（血凝板）中用PBS进行2倍梯度稀释至2-11，以50 μL PBS为空白对照。每一行分别加入a、b、c、d四种1%RBC悬浮液50 μL，混合，37 ℃孵育20 min后，观察红细胞凝聚情况，读取HA滴度，统计HA效价差异，分析受体结合能力。

2 结果与分析

2.1 禽流感病毒的分离鉴定与序列分析

采用RT-PCR方法扩增获得了2株禽流感病毒全基因组片段（图1），测序得到2个毒株的全基因组序列。将序列在NCBI上进行Blast分析，确定分离毒株为H7N9亚型禽流感病毒，2株分离株的内部基因来自H9N2亚型AIV。将分离到的2个株病毒分别命名为：A/chicken/Hubei/093/2017（H7N9），缩写为CK93;A/chicken/Hubei/207/2017（H7N9），缩写为CK207。2株分离株8个基因的全长RT-PCR扩增产物电泳分析如图1所示。

2.2 HA与NA基因的遗传进化及同源性分析

自2014年以来，中国报道的H7N9亚型禽流感病毒主要分为2个进化分支，长江三角洲谱系和珠江三角洲谱系[11]。HA和NA基因序列遗传进化树如图2和图3所示，结果显示①同一地区的毒株之间进化关系较近;②同一时间暴发的病毒之间进化关系较近，例如2013年暴发在上海和安徽的毒株同源性较高，2017年暴发在黑龙江和江苏的毒株同源性较高;③与CK93的HA基因同源性最高的是人源毒株A/Suzhou/59/2016（H7N9），同源性为99.88%;CK207的HA与禽源毒株A/Chicken/Guangxi/GX102/ 2017（H7N9）的HA同源性为99.71%;④与CK93的NA基因同源性最高的是人源毒株A/inner Mongolia/Tongliao29169/2017，同源性为99.79%;与CK207最接近的是A/Guangdong/S11523/2017（H7N9），同源性为99.28%;⑤CK93和CK207的HA核酸序列同源性在96.33%，氨基酸序列同源性为96.63%;NA核酸序列同源性在99.3%，氨基酸序列同源性为96.99%;⑥CK93和CK207均起源于欧亚地区，但CK93在中国的进化分支中属于长江三角洲谱系，CK207可能来源于珠江三角洲谱系。

2.3 HA、NA基因的糖基化位点分析

利用糖基化位点预测服务器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）对HA和NA氨基酸糖基化位点进行了预测。HA有5个潜在糖基化位点（表1），分别为46NAT48、249NDT251、421NWT423、493NNT495。对比发现，CK207株与其他研究报道的H7N9毒株相比，糖基化位点并未发生改变，而CK93株的HA缺失糖基化位点30NGT32。HA的糖基化位点的缺失与病毒传播效率及致病性的差异密切相关[12]，CK93病毒HA糖基化位点的改变是否对其传播有影响值得关注。NA的糖基化位点有7个，为42 NCT44、52 NTS54、63 NET65、66 NIT68、87 NLT89、142 MGT144、187 NAS189，CK93和CK207 2株NA的糖基化位点与早期报道的H7N9毒株相同。

2.4 高致病性与低致病性H7N9亚型禽流感病毒关键氨基酸位点分析

对2株病毒的HA裂解位点分析比对结果（表2）显示，CK93的裂解位点为PEIPKGR↓GLF，含1个碱性氨基酸精氨酸（R），为低致病性禽流感病毒的位点特征;CK207的裂解位点为PKRKRAR↓GLF，含有5个碱性氨基酸，其中4个（KRKR）是连续的，为高致病性裂解位点。2株病毒均发生了D186V（H3 numbering）;CK93的226位突变为亮氨酸（L），而CK207为226谷氨酰胺（Q）。2毒株与毒力相关的HA位点第225位氨基酸均由天冬氨酸突变为甘氨酸（D225G），有研究表明此位点突变与禽流感病毒毒力增强有关[13]。

文献报道结果显示，N9亚型NA的酶活性位点可能与119R、120E、122Y、135L、147D、152R、180W、220N、226R、229E、245D、276H、278E、279E、294R、332D、351K和427E密切相關[14]，分析发现2毒株NA蛋白酶活性位点均未发生改变。NA蛋白N端第135～152位氨基酸很有可能是抗原决定簇位点所在，分别为135T、136I、137R、138G、138K、140H、141S、142N、143G、145I、146H、147D、148R、149S、150Q、151Y和152R[15]，2个分离株的这些位点与已报道的H7N9毒株并无差别。但2个分离株NA在属于茎区（Stack：36-90位）的69-73位缺失5个氨基酸QISNT（表2）。

2.5 病毒的受体结合分析

通过HA血凝特性测定了2株H7N9病毒（CK93和CK207）的受体结合特异性。鸡红细胞（cRBCs）的表面含有α-2，3-连接和α-2，6-连接的唾液酸受体。用α-2，3-唾液酸酶处理的cRBC仅含有α-2，6-连接的唾液酸受体，用霍乱弧菌神经氨酸酶（VCNA）处理的cRBC不含受体，而绵羊红细胞（sRBCs）的表面仅含有α-2，3-连接的唾液酸受体。受体结合特异性测定结果显示，2株H7N9病毒都可以凝集未处理的cRBC和sRBC，对α-2，3唾液酸酶处理过的cRBC表现出良好的亲和性，但不能凝集VCNA处理的cRBC。图4结果表明，两株H7N9病毒都保持了既对禽类（α-2，3）受体的亲和力，又具有与人类（α-2，6）受体结合的特性。

3 小结与讨论

H7N9亚型禽流感病毒是禽源性的三源重组病毒，含有家鸭来源的HA基因、野生鸟类NA基因和家禽H9N2内部基因[16]。在流行过程中，H7N9存在不同亚型病毒间进行基因片段重组的可能，导致新流行株的产生。人感染新型H7N9禽流感病毒以重症病例为主，表明该H7N9病毒与其他H7亚型相比对人有更强致病力[17]。因此，加强对H7N9禽流感病毒的病原学监测和生物学特性研究，跟踪了解病毒的变异及进化趋势，对于制定H7N9禽流感的有效防控策略有重要意义。

本研究的2株H7N9亚型禽流感病毒湖北地方分离株CK93和CK207均起源于欧亚地区，在中国进化分支中属于长江三角洲谱系，6个内部基因起源于H9N2。但CK93跟人源毒株同源性更高，而CK207跟禽源毒株同源性更高，说明这2个毒株来自不同的进化分支，CK93的HA可能来源于人，CK207则来源于禽类。

有研究表明，H5N1亚型禽流感病毒HA糖基化位点的缺失曾导致病毒传染性的改变，导致人感染高致病性禽流感[18]。因此，CK93株HA基因糖基化位点存在缺失可能影响其致病性与毒力。HA 蛋白的裂解位点是决定禽流感病毒致病性的关键性因素之一。CK93的裂解位点为H7N9亚型AIV普遍的低致病性裂解位点PEIPKGR↓GLF，而CK207的裂解位点处插入了4个碱性氨基酸（KRKR），突变为PKRKRAR↓GLF，为高致病性裂解位点。毒力相关位点225也由天冬氨酸突变为甘氨酸（D225G），也可能导致病毒毒力增强。NA茎区69-73缺失5个氨基酸（QISNT），也是毒力增强的分子标志。研究表明，NA茎区的氨基酸缺失与从水鸟传播到陆地家禽的AIV有关，该缺失使病毒在家禽中更稳定，可能增强病毒的复制能力[19]。

目前已确诊的人感染H7N9禽流感病例中80%以上有禽或禽类相关环境（活禽市场）暴露史，传播途径主要是由禽感染人。禽流感病毒要突破种间屏障感染人，必须发生受体结合偏好性改变，这种偏好性取决于病毒HA受体结合位点（Receptor binding site，RBS）的关键氨基酸。受体结合位点有130环（131-138）、140环（140-145）、220环（219-228）、190螺旋（190-196）以及部分150环（156-160），RBS区域关键位点氨基酸的改变会导致病毒受体结合特性的转换。有研究表明，人源H7N9病毒与α-2，6唾液酸受体结合特性可能与引入了2个疏水残基的Q226L和G186V突变有关。将HAs中220环与130环之间的间隔扩大了1 ？，改变了其空间构象，提高了病毒对人源受体的亲和力[20]，从而增强了病毒对人的感染能力。本研究的2株H7N9毒株均发生了G186V突变，CK93发生了Q226L，而CK207仍保留了大部分H7N9毒株普遍的HA-226Q，但是2个毒株均可以结合人源α-2，6唾液酸受体，表明本研究中的H7N9病毒获得的人源α-2，6唾液酸受体结合能力，不只是由HA基因226位氨基酸决定的。用DNAMAN软件得知，2株分离株的HA氨基酸序列除了裂解位点与第226位氨基酸发生了突变，还有13处氨基酸位点存在差异，可能会对病毒受体结合能力产生影响。关于病毒受体特异结合的影响因素，将设计试验进行进一步的研究。

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