单亲二倍体对法医DNA检测的影响与分析

郭宏，毛君，刘英华，向菁菁，刘敏娟

（1.南京医科大学附属苏州医院司法鉴定所，江苏 苏州 215002；2.南京医科大学附属苏州医院生殖与遗传中心，江苏 苏州 215002）

单亲二倍体（uniparental disomy，UPD）是指在染色体核型中，某些同源染色体或染色体上的部分片段均来源于双亲中的一方，未检测到另一亲本来源的染色体或染色体的部分片段[1]。单亲本来源在法医学检案中可以表现为短串联重复（short tandem repeat，STR），不符合孟德尔遗传定律。本研究通过2个家系不同染色体来源的单亲二倍体来展示这一现象对法医DNA检测产生的影响，希望给法医工作者提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

胎儿确诊为UPD的2个家系（家系A和家系B）。每个家系的父母均采集外周静脉血10mL，采用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，4℃保存。孕妇羊水10 mL，3 044×g离心15 min，弃去上清液，4℃保存。

1.2 主要试剂及仪器

CytoScan 750K array芯片、Chromosome Analysis Suite 3.1（ChAS 3.1）软件（美国Affymetrix公司），MicroreaderTM21 ID System、MicroreaderTM23sp ID System（苏州阅微基因技术有限公司），QIAamp DNA Investigator试剂盒、QIAamp DNA Blood Mini试剂盒（德国QIAGEN公司），3130xl基因分析仪、Gene-Mapper 3.2软件（美国Applied Biosystems公司），NanoDrop 2000c分光光度计（美国Thermo Scientific公司）。

1.3 方法

1.3.1 染色体微阵列芯片检测

使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒对胎儿羊水细胞进行基因组DNA的提取，NanoDrop 2000c分光光度计检测DNA的浓度与纯度，确保DNA质量在合格范围内（1.8＜D260/D280＜2.0，1.9＜D260/D230＜2.5），然后将DNA稀释至30～60ng/μL用于芯片实验。

对上述DNA采用全基因组CytoScan 750K array芯片按推荐的标准操作程序进行SNP-array检测，主要操作步骤为：将基因组DNA消化、连接、扩增、纯化、片段化、标记、探针杂交、洗涤和扫描后，使用配套的ChAS 3.1软件进行数据分析。定义DNA拷贝数变异（copy number variation，CNV）均≥200 kb，杂合性丢失（loss of heterozygosity，LOH）区域片段大于10 Mb，且可信度≥90%进行结果判读，同时参考美国医学遗传学会（American College of Medical Genetics，ACMG）[2]、中国医师学会医学遗传学分会等专业学会制定的《染色体基因组芯片在儿科遗传病应用的指南和共识》[3]，并检索参考数据库DGV[4]、ClinGen[5]、Clinvar[6]、DECIPHER[7]、OMIM[8]，结合本实验室内部数据以及PubMed基因数据库[9]等进一步完成综合分析。

1.3.2 STR基因座检测

采用QIAamp DNA Investigator试剂盒按照标准化操作流程提取父母外周血和孕妇羊水的DNA。使用MicroreaderTM21 ID System以及MicroreaderTM23sp ID System检测包含Amelogenin基因在内的D19S433等39个基因座，使用3130xl基因分析仪进行荧光检测，由GeneMapper 3.2软件进行STR分型。

2 结 果

2.1 染色体微阵列芯片检测结果

将芯片扫描的原始数据导入ChAS 3.1软件进行分析，选取“LOH”选项，设定显示阈值为10M（即大于10M的LOH用紫色标注条显示），若整条染色体都有紫色标注条，则提示该染色体为UPD。

检测结果显示，家系A胎儿7号染色体为UPD，家系B胎儿8号染色体为UPD。未检测到其他染色体拷贝数异常及UPD的情况。

2.2 基因型检测结果

2个家系的父母外周血及孕妇羊水采用MicroreaderTM21 ID System和MicroreaderTM23sp ID System检测39个STR基因座，均检测到不符合孟德尔遗传定律的STR基因座（图1），其中，家系A的位于7号染色体，基因座为D7S820和D7S3048，前者基因型为母（9，10）、子（12，12）、父（12，13），后者基因型为母（18，21）、子（22，22）、父（20，22）。家系B的位于8号染色体，基因座为D8S1179和D8S1132，前者基因型为母（15，15）、子（15，15）、父（14，16），后者基因型为母（20，23）、子（20，20）、父（21，23）。

图1 2个家系不符合孟德尔遗传定律的基因型分型结果Fig.1 Genotyping results of two families not consistent with Mendel’s laws of inheritance

3 讨 论

根据孟德尔遗传定律，正常个体的23对同源染色体分别来自父母双方，而UPD个体的同源染色体只来源于一方亲本。1988年，SPENCE等[10]首次报道了1例囊性纤维化病变并且身材矮小的患者，检测到囊性纤维化穿膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）基因纯合突变是UPD导致的。由于种种原因，针对UPD的筛查并未列入常规产前诊断项目，除了某些严重影响胚胎生长发育而导致早期流产的UPD，有些无任何异常临床表型的UPD患者和UPD继发性单基因纯合突变导致的隐性遗传病患者是可以正常出生的[10]。因此，在法医学研究领域，由于UPD的单亲本来源，可能导致亲子关系的假性排除。BEIN等[11]报道了1例假性排除父权的亲子鉴定案例，孩子与父亲在16号染色体上出现了多个不符合孟德尔遗传定律的遗传标记，遗传学根据为孩子16号染色体表现为母源性UPD。本研究中的2个家系，放在日常亲子鉴定检案中，如果按标准三联体，要求鉴定可疑父与孩子的关系，在使用MicroreaderTM21 ID System时，家系A与家系B均检测到不符合孟德尔遗传定律的STR基因座，我们可视为突变，家系A突变来源于母亲，家系B突变来源于父亲，不过，突变对鉴定意见不会产生影响，累积父权指数（combined paternity index，CPI）均能达到“支持被检父与孩子之间存在亲生血缘关系”的标准。但是，领养、公证、入户等越来越多的委托要求为鉴定父亲（或母亲）与孩子之间的关系，此时，家系A在D19S433等20个基因座的母子CPI为5 346.247 9，家系B在D19S433等20个基因座的父子CPI为1613.5069，按照《亲权鉴定技术规范》（GB/T 37223—2018），无法进行亲权关系的认定或排除。两家系样本补充检测MicroreaderTM23sp ID System后，家系A在D19S433等39个基因的母子CPI为528 184.995 8，家系B在D19S433等39个基因座的父子CPI为479930196.3297，此时，两家系中母子及父子关系的CPI值均大于10000，可达到认定亲权关系的标准。与此同时，我们发现两家系均存在两个STR基因座不符合遗传定律，且位于同一条染色体，结合本研究芯片结果，确证两家系胎儿均为UPD患者。

UPD的形成机制包括配子互补、三体自救、单体复制、有丝分裂异常等，其发生的易感因素包含高龄孕产以及药物促排卵等[12]。

依据检测结果，按照涉及染色体数目以及形态，UPD的类别可为片段化UPD（非整条染色体）、整条染色体UPD、复杂型UPD（伴有等臂染色体、易位染色体等）、全基因组UPD。UPD的致病机制主要包含嵌合体致发育异常、单基因纯合突变（隐性遗传病）、基因印迹障碍等，而且这些因素往往不是单一存在，从而致使患者的临床表型多样化[10]。在法医学领域，在STR分析时，如果UPD涉及整条染色体，相对容易判断。片段化或复杂型UPD情况就要复杂得多，容易造成错判漏判[13]。

对于UPD的诊断，目前常用的诊断技术有微卫星标记（又称STR）分析、特异性甲基化检测、染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）、全外显子测序以及全基因组测序等[14]。如果患者符合某已知UPD类型致病表型，可使用STR或者特异性甲基化检测进行针对性检测；测序或者CMA，主要用于难以判断的UPD或者查找隐性基因的具体突变基因座。结合产前超声检查，如若发现胎儿结构异常，CMA则是目前最有效的遗传学诊断方法[15-17]。通过固定在基质上的高密度DNA探针与经荧光标记的样本DNA特异性杂交，最后根据荧光强度，测出样本DNA的碱基类别，发现染色体变异。本研究所使用的Affymetrix CytoScan®750K array芯片，包含20万个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）探针标记（对于＞400 kb的拷贝数变化，灵敏度和特异性高于99%）和55万个CNV寡核苷酸探针标记，针对遗传疾病相关基因和癌症相关基因增加探针覆盖，可以精确检测UPD、LOH、CNV和血缘一致性（identity by descent，IBD），甚至低水平的嵌合体以及样品异质性都能有效检测。需要注意的是，无论采取哪种检测方法，都应同步检测父母双方，目的是核对验证以及后续生育指导。

在法医学亲子鉴定中，常规使用的荧光检测试剂盒比较难以发现UPD，当疑似突变发生，在亲权指数不足10000进而增加补充基因座时，如若再次出现不符合孟德尔遗传定律的STR基因座，且位置在与疑似突变基因座相同的染色体上，疑似等位基因LOH的突变，此时，需高度怀疑UPD的发生，应对方法为增加检测基因座、使用单条染色体STR检测试剂盒或者基因芯片等技术进行进一步检测[13]。