益气化瘀方联合干细胞移植促进脊髓损伤修复的实验研究※

●周瑞娟 卢晓惠 张秋萍 陈海鹏 徐 浩 刘书芬 徐乐勤▲

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种严重的中枢神经系统损伤，全球范围每年平均每百万人口中约有10.4～83人发生SCI[1]。该疾病可导致严重的运动、感觉和自主神经功能障碍，给患者日常生活带来极大的痛苦，同时也给家庭和社会带来沉重的负担。细胞移植是目前神经再生领域研究热点之一，也是最有希望治愈SCI的方法之一[2]。当前可用于移植的细胞种类有诱导性多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPS）、神经干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、嗅鞘细胞、雪旺细胞等[2-3]。本课题组前期实验表明，过表达Mash-1基因可促进胚胎干细胞（CE3小鼠胚胎干细胞）在体外[4]和脊髓损伤部位向神经细胞分化[5]。在实验中，本课题组也观察到移植细胞在脊髓损伤部位的存活数量较少。文献报道，移植细胞的存活数量多少与脊髓损伤的炎症环境密切相关[6]。

在既往的研究中，本课题组观察到益气化瘀方可减轻慢性脊髓损伤的炎症反应[7]；促进背根节细胞表达BDNF[8]，抑制caspase-3和bax的表达[9-10]，进而减少背根节细胞的凋亡。由此可见，益气化瘀方具有改善炎症反应，促进周围神经损伤修复的作用。因此，本实验拟在前期研究基础上，进一步观察益气化瘀方联合移植过表达Mash-1基因的胚胎干细胞对脊髓损伤的修复作用。

1 材料与方法

1.1 动物KM种小鼠60只，雄性，无特殊病原体（specific pathogen free，SPF）级，6～8周龄，体重（20±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。

1.2 试剂DMEM、L-gul、β-mercaptoethanol、胰酶（GIBCO公司，美国）；FBS（BIOCHROM公司，英国）；LIF细胞因子（CHEMICON公司，美国）；nestin抗体、β-tubulin III抗体（Abcam公司，英国）；荧光二抗（KPL公司，美国）；逆转录试剂盒、荧光素酶（TAKARA公司，日本）。益气化瘀汤剂由上海中医药大学附属龙华医院提供（组成：黄芪15g，党参12g，丹参9g，川芎9g，人工麝香0.03g。煎煮浓度为1g生药/mL）。

1.3 细胞悬液的制备按前期的实验方法培养Mash-1基因修饰的小鼠胚胎干细胞（CE3-Mash-1细胞）[5]。细胞移植注射前，采用0.125%胰酶消化，终止后吹打成单个细胞悬液，离心，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗2次，通过计数板计数确定细胞总数，然后用生理盐水重悬细胞，调整细胞浓度为5×104个/μL备用，移植前将细胞悬液置于冰上保存。

1.4 小鼠急性脊髓损伤模型建立、分组及治疗给药小鼠购买后适应性喂养3天。按体重随机分为假手术组、模型组、益气化瘀方组（以下简称中药组）、Mash-1修饰胚胎干细胞移植组（以下简称干细胞组）、益气化瘀方联合Mash-1修饰胚胎干细胞移植组（以下简称联合组）。假手术组只暴露脊髓不予Dumont 5号镊夹持损伤脊髓。其余各组按Plemel JR报道[11]的方法建立急性脊髓损伤模型，具体步骤如下：采用氯胺酮腹腔注射麻醉小鼠（给药剂量0.05mL/10g体重），麻醉后将小鼠固定于俯卧位，逐层暴露T13节段脊髓，随后采用Dumont 5号镊从前后方向夹持脊髓15s，无菌纱布轻轻压迫止血，逐层缝合。术后第1天，采用小鼠后肢运动功能（Basso mouse scale，BMS）评分[8]验证模型是否成功。所有动物术后连续3天给予腹腔注射50,000U/kg的青霉素；挤压膀胱辅助排尿至自身排尿反射恢复。

术后第3天，根据小鼠体重，采用氯胺酮麻醉小鼠，固定于俯卧位，碘伏常规消毒，拆除背部的缝线，直接暴露损伤的脊髓节段。暴露完成后，干细胞组及联合组用10μL的微量进样器抽取之前准备好的细胞悬液，移植的细胞数目为1×105个，即2μL的细胞悬液，注射到脊髓损伤部位中心，垂直进针，进针深度为1.5mm，以缓慢的速度注射，注射后留针2min；假手术组、模型组、中药组给予注射2μL生理盐水。

待小鼠苏醒后，中药组、联合组给予益气化瘀汤剂（0.1mL/10g体重）灌胃；假手术组、模型组、干细胞组给予等体积生理盐水灌胃。每天灌胃1次，连续给药4周。各组小鼠分别于建模后的1、7、14、21、28天进行BMS评分。

1.5 脊髓标本的取材与固定分别于脊髓损伤建模后的14和28天，采用10%水合氯醛麻醉，每组处死6只小鼠。其中，3只小鼠的脊髓标本放置于4%多聚甲醛中固定，另3只小鼠脊髓标本放置于液氮中保存，择期抽提总RNA。小鼠脊髓标本经4%多聚甲醛固定16h后倒去固定液，清水冲洗2h后，将标本放置于15%和25%蔗糖溶液中各脱水24h，最后去除蔗糖溶液，经OCT胶包埋，冰冻切片机将小鼠脊髓切成5μm厚度组织切片，用防脱载玻片粘取组织。切片完成后放置于室温通风1天，晾干切片，装入切片盒中，放置-20℃冰箱保存。

1.6 HE染色从-20℃冰箱取出切片，室温放置10min；将切片放置于清水中5min；苏木素2min；清水冲洗；0.04%的盐酸酒精分化5s；清水冲洗；2%氨水返蓝10min；清水冲洗；伊红2min；清水冲洗；85%、95%、100%梯度乙醇各2min；二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III各2min；中性树胶封片；60℃烤箱烘烤过夜；Olympus相差显微镜采片。

1.7 免疫荧光染色从-20℃冰箱中取出切片，放置于PBS中浸泡5min，取出切片放置于湿盒中，用纸巾擦除组织周围的水分，蛋白酶K消化10min（修复抗原），PBS洗2min×3次，0.5%PBST通透20min，PBS洗2min×3次，加入5%BSA封闭20min，加一抗OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP（1：500稀释），4℃过夜。37℃恒温箱孵育1h，PBS洗5min×3次，红色荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1h，PBS洗5min×3次，加入1μg/mL的DAPI室温避光孵育10min，PBS洗2min×3次，荧光显微镜下采片。阴性对照用PBS代替一抗。

1.8 RNA抽提及real-time PCR从液氮中取出脊髓组织，用分析天平秤取100mg脊髓组织，用去酶的眼科剪将脊髓组织剪碎，加入1mL TRIZOL，常规抽提总RNA，经紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度后，采用TAKARA逆转录试剂盒按试剂盒实验步骤将RNA转录成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR检测BDNF、CNTF、NGF、NT3、IL-1、IL-6、TNF-α、MIP2、caspase-3、bax、bcl-2及β-actin的基因表达情况。

根据GenBank检索目的基因序列设计引物，采用primer 5软件设计扩增引物序列，由华大基因公司合成引物序列。各基因名称和序列见表1。PCR结果采用ΔCt法进行分析（Ct为循环阈值）和2-ΔΔCt表示各组间各基因的表达差异。

表1 神经营养因子、炎症因子和凋亡相关基因名称和引物序列

1.9 统计方法应用SPSS 20.0统计分析软件处理数据，计量资料数据均以表示。先对各组数值变量进行正态性分析，不符合正态分布的数据采用非参数检验。符合正态分布的数据，进一步检验方差齐性。方差齐时两组间数据比较采用独立样本t检验，多组数据间的比较采用单因素方差分析LSD-t法检验。方差不齐时，组间数据比较采用非参数Mann-Whitney U检验。

2 结果

2.1 功能评分术后第1天，假手术组的小鼠后肢的运动功能均为正常，评分值为9分；造模后各造模组的小鼠后肢出现明显运动功能障碍，评分均为0。术后第7天，即细胞注射和给药后第4天，干细胞组和联合组的小鼠后肢运动功能有部分恢复，与模型组和中药组比较均具有统计学差异（P＜0.05）。在造模后的第14、21和28天，干细胞组和联合组的小鼠后肢运动功能进一步恢复，与模型组和中药组比较均具有统计学差异（P＜0.01）。在造模后第21和28天时，联合组小鼠后肢运动功能明显优于单纯细胞移植的干细胞组，比较具有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）。中药组小鼠的后肢运动功能评分略高于模型组，但无明显的统计学差异（P＞0.05）。见图1、表2。

图1 术后第28天各组小鼠的后肢运动功能照片

表2 BMS评分（分，）

表2 BMS评分（分，）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与中药组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与干细胞组比较，※P＜0.05，※※P＜0.01

2.2 脊髓横切面HE染色从脊髓横切面HE染色可见，在造模后的14天和28天时，模型组和中药组小鼠的脊髓横切面剩余面积明显减少，与假手术组比较存在统计学差异（P＜0.01）。干细胞组和联合组的小鼠脊髓剩余面积均有明显的恢复，与模型组和中药组比较具有统计学差异（P＜0.01）。假手术组、干细胞组和联合组三组间的脊髓剩余面积无明显差异（P＞0.05）。见图2、表3。

图2 造模后14d和28d时各组脊髓横切面HE染色图

表3 脊髓横切面剩余面积（μm2，）

表3 脊髓横切面剩余面积（μm2，）

注：与模型组比较，**P＜0.01；与中药组比较，▲▲P＜0.01

2.3 免疫荧光结果由于CE3胚胎干细胞带有GFP，因此可在荧光显微镜下通过绿色荧光跟踪移植细胞在体内的存活数量和所在位置，进一步通过带红色荧光的二抗与不同的一抗结合可观察到移植的细胞在体内的存活和分化情况。免疫荧光染色结果显示，干细胞组与联合组的OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP四种细胞标记蛋白的阳性细胞比例无明显差别，见图3和表4。但在造模后的第28天，联合组的细胞存活数目明显多于干细胞组。见图4、表5。

图3 术后第14d和28d，脊髓组织免疫荧光染色图

表4 移植细胞在损伤脊髓部位的分化情况（%，）

表4 移植细胞在损伤脊髓部位的分化情况（%，）

注：两各细胞移植组的OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP四种细胞标记蛋白的阳性细胞比例无明显差别（P＞0.05）

图4 造模28d后干细胞组和联合组的移植细胞在脊髓损伤部位的存活情况图

表5 造模14和28d后两组移植细胞的存活数量（个，）

表5 造模14和28d后两组移植细胞的存活数量（个，）

注：与干细胞组比较，##P＜0.01

2.4 基因表达改变情况本实验主要检测各组小鼠损伤脊髓的神经营养因子(BDNF、CNTF、NGF、NT-3)、炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2)和凋亡相关基因(caspase-3、bax、bcl-2)的表达情况。在造模14天时，模型组的炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相关基因caspase-3的表达明显增高；中药组的炎症因子IL-1、TNF-α 和凋亡相关基因caspase-3的表达相对模型组减少，同时神经营养因子BDNF的表达略微升高；干细胞组和联合组小鼠的炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相关基因caspase-3的表达明显降低，同时神经营养因子的BDNF、CNTF、NGF、NT-3表达均有升高。此时，干细胞组和联合组在以上几种基因的表达无明显差别（见图5 A）。在脊髓损伤28天时，模型组小鼠脊髓的炎症因子TNF-α和神经营养因子BDNF、NT-3的表达相对假手术组均有升高；中药组的炎症因子TNF-α表达相对模型组降低，同时略微增加神经营养因子BDNF的表达；干细胞组小鼠的炎症因子TNF-α和神经营养因子BDNF、CNTF、NT-3的表达均升高；而联合组的神经营养因子BDNF、CNTF、NT-3的表达上升，且相对模型组和干细胞组其炎症因子TNF-α表达明显下降（见图5 B）。

3 讨论

益气化瘀方能轻微改善小鼠脊髓损伤后的神经功能，可能通过减少炎症因子IL-1、TNF-α 和凋亡相关基因caspase-3的表达，促进神经营养因子BDNF、NT-3的表达，进而减轻脊髓的继发性损伤。文献报道，益气化瘀方可以减轻慢性脊髓损伤和椎间盘退变引起的炎症反应[7,12]。在之前的实验中，益气化瘀方可减少的背根节神经细胞[9]和椎间盘纤维环细胞[13-14]、软骨细胞[15]表达caspase-3和bax基因。本研究表明，益气化瘀方联合干细胞移植能显著保留脊髓的横切面剩余面积，减少炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相关基因caspase-3的表达，同时增加神经营养因子的BDNF、CNTF、NGF、NT-3表达，增加移植细胞在损伤脊髓部位的存活，进而提高小鼠后肢运动功能。

图5 造模后14 d和28d各组神经营养因子、炎症因子和凋亡相关基因的表达情况图

益气化瘀方由黄芪、党参、川芎、丹参、人工麝香组成。方中重用黄芪，其味甘，性微温，入脾、肺，具有补中益气、利水消肿之功，可大补脾胃之元气，使气旺血行、瘀去络通而为君。党参补中益气，健脾益肺为臣，与黄芪合用以增强健脾益气之功。川芎辛、温，行气开郁、活血止痛，善行血中之气；丹参活血化瘀、行气止痛，配合川芎则有行气活血、祛瘀生新之效，共为佐药。使以麝香辛香走窜,活血通络、散瘀止痛，以助黄芪、丹参行气化瘀之功。全方共奏益气化瘀通络之效。

脊髓损伤后炎症因子的表达明显上升，实验研究表明通过减轻脊髓损伤后的炎症反应具有一定的治疗作用。中药黄芪、丹参和川芎均具有提高SOD活性，减少继发性损伤，促进神经功能恢复[16-18]。而且，中药有效组分麝香提取物、丹参酮IIA和黄芪总苷对神经损伤后的多条信号通路进行调节，进而起到提高神经元存活、促进轴突再生、抑制细胞凋亡和抗炎等作用[19-22]。神经营养因子主要由少突胶质细胞和星形胶质细胞分泌，具有营养神经元、促进轴突生长等作用。文献报道，中药复方（痉证方[23]、补阳还五汤[24]、活血通督汤[[25]、通窍活血汤[26]、桃红四物汤[27]）、单味中药（黄芪[28-29]、丹参[16]）和中药有效组分（川芎嗪[30]、麝香酮[31]）具有促进神经营养因子NGF、BDNF、CNTF和NT-3的基因表达。脊髓损伤后的凋亡相关基因高表达，引起神经细胞凋亡也是导致脊髓神经功能障碍的主要原因之一。活血通督汤[32]、补阳还五汤[33]、活血醒脑方[34]、血府逐瘀汤[35]等活血化瘀复方均具有减少神经凋亡的作用。黄芪配伍丹参或配伍川芎可减少大鼠出血或缺血模型的脑细胞凋亡[36-37]。在中药单体方面，丹酚酸B[38]和川芎嗪[39-40]能调节自噬、氧化应激反应，减少脊髓损伤后caspase-3的表达，保护线粒体，从而减少神经细胞凋亡。现代药理还表明黄芪、丹参、党参和川芎可以保护血管内皮、调节血流状态、改善局部微循环、清除氧自由基、减轻脂质过氧化损害，并具有一定的调节免疫、抗炎镇痛的作用[18,41-44]。脊髓损伤后，上述中药一方面可以通过减轻炎症反应、清除自由基、调节免疫等保护正常的神经元和髓鞘，另一方面可以通过改善损伤微环境、增加血供，为存活的神经细胞提供营养物质，为移植细胞提供有利的微环境，增加移植细胞的存活，从而促进轴突和髓鞘的再生，最终达到促进脊髓神经功能修复的作用。