慢性冷应激对放牧西门塔尔母牛免疫功能、抗氧化功能及血清激素分泌的影响

陈 浩，敖日格乐，王纯洁，斯木吉德，阿日查，张 剑，刘 波

(1.内蒙古农业大学 动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018;2.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

牛肉具有低脂肪、低胆固醇、高蛋白及富含微量元素等优点，在人们所食用的肉产品中所占份额越来越高[1]。据统计，2017年我国人均牛肉消费量为5.8 kg/人，连续7年保持上升趋势；牛肉市场供不应求，2018年我国牛肉进口量为106万t，同比增长51.42%[2]。在这一形势下，国家不断加大标准化养殖推进力度[3]。但由于我国北方地区冬季低温环境极易引起肉牛产生冷应激，导致肉牛生产性能及繁殖性能下降，发病率及死亡率增高，给我国北方肉牛养殖业造成了巨大的经济损失，这严重的限制了我国肉牛产业的健康迅速发展[4-6]。

在低温环境刺激下，处于冷应激状态的动物机体启动一系列非特异性的自身免疫反应缓解应激带来的影响，这个过程会引起血液中一些生化指标的变化，并造成动物机体免疫功能及抗氧化功能的损伤[7-8]。近年来，对肉鸡冷应激的研究表明，冷应激12 h时肉鸡血清中IgA、IgG极显著上升，并在试验结束时(150 h)仍维持在较高水平[9]。杨莉等[10]通过比较冷应激对羊免疫功能的影响，结果表明冷应激后阿勒泰羊和湖羊血清IL-2和IL-4的浓度均呈下降趋势。KAUSHIK等[11]研究发现，冷应激可使 脑、心脏、肾脏的SOD活性显著下降。有研究报道冷应激状态蒙古牛血液中的T3、T4及ACTH浓度相较于非应激状态下显著升高[12]。

西门塔尔牛是乳肉兼用品种，原产于瑞士的阿尔卑斯山区，现已分布许多国家，成为世界上数量最多，分布最广的乳肉兼用品种之一[13]。锡林郭勒草原位于我国内蒙古自治区北部高寒地区，寒冷期长达7个月，极端低温可至―42.4℃，该地区西门塔尔牛饲喂方式以粗放的放牧为主，因此在冬春两季长时间遭受冷应激侵扰[12]。

目前，关于动物冷应激的研究较少，关于冷应激对放牧牛血液生化指标影响的研究报道更少。因此，本研究拟以放牧西门塔尔母牛为试验群体，检测试验个体在冷应激与非应激状态下的血液生化指标，探讨冷应激对西门塔尔母牛免疫功能、抗氧化功能及血清激素分泌的影响，进一步了解冷应激对肉牛机体影响的生理机制，旨在为我国北方草原放牧肉牛冬季的保温抗病及冷应激相关研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理以内蒙古锡林郭勒盟苏尼特左旗某天然草场提供的16 头2～4岁，体质量为(380±20)kg且健康状况良好的放牧西门塔尔母牛作为试验动物。试验牛饲养管理方式为全年放牧，自由采食牧草和饮水。

1.2 试验时间及地点在内蒙古锡林郭勒盟苏尼特左旗某天然草场进行。试验分为2 个阶段进行：秋季(2017年9月28-30日)和冬季(2018年1月29-31日)。

1.3 环境温湿度测定由于试验是以在天然草场进行全年放牧的肉牛为研究对象，所以所测的环境指标均为自然环境下的温度和相对湿度。试验期间，测定每天8:00，14:00，20:00的天然放牧草场的温度和相对湿度，并监测记录试验当月的平均气温和相对湿度。

1.4 血样采集在试验期最后1 d清晨对每头试验牛进行颈静脉采血。用非抗凝采血管采集10 mL血液，静置0.5 h后3 000 r/min离心10 min，分离制备血清，置于-20℃冰箱中保存供血液生化指标的测定

1.5 血液指标测定血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、SOD、MDA、T-AOC、T3、T4、ACTH、GH、GC和TSH含量测定采用酶联免疫分析法，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，测定方法按照试剂盒说明书进行操作。血清GLU和BUN使用日立7600生化仪检测。

1.6 数据分析采用Excel 2003对所有试验数据进行初步整理后，使用SPSS 17.0中的单因素方差分析(one-way ANOVA)进行差异显著性分析，结果用平均值±标准差方式表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 肉牛放牧草场试验期温湿度结果见表1，2和3。在各试验阶段中，秋季放牧草场的最低温度为12.5℃，最低湿度为41%(表1)。冬季放牧草场的最低温度为-23.5℃，最低湿度为35%(表2)。根据监测结果发现，秋季放牧草场的月平均气温为13℃，湿度为42%，冬季放牧草场的月平均气温为17.5℃，平均相对湿度为34%(表3)。

表1 秋季自然放牧环境的温湿度

表2 冬季自然放牧环境的温湿度

表3 不同季节平均气温和湿度

2.2 不同季节西门塔尔母牛血清免疫指标变化结果见表4。西门塔尔母牛遭受慢性冷应激后，血清中IgA、IgG、IL-2和IL-4的浓度显著下降(P<0.05)，与非应激状态相比，IgM的浓度有下降的趋势，但差异不显著(P>0.05)。

表4 不同季节西门塔尔母牛血清免疫指标测定结果

2.3 不同季节西门塔尔母牛的抗氧化指标变化结果见表5。慢性冷应激对西门塔尔母牛SOD活性无显著影响(P>0.05)，但由于低温环境的刺激，冷应激状态下西门塔尔母牛血清MDA浓度显著升高(P<0.05)，T-AOC浓度显著降低(P<0.05)。

表5 不同季节西门塔尔母牛的抗氧化指标测定结果

2.4 不同季节西门塔尔母牛血清激素分泌变化西门塔尔母牛在秋季和冬季血清激素分泌测定结果见表6。冷应激使西门塔尔母牛血清中T3、T4和GLU的浓度显著升高(P<0.05)，GH、GC和ACTH的浓度显著降低(P<0.05)，两种应激状态下TSH和BUN的浓度无明显变化(P>0.05)。

表6 不同季节西门塔尔母牛血清激素分泌测定结果

3 讨 论

3.1 慢性冷应激对西门塔尔母牛免疫功能的影响细胞因子是由免疫细胞和一些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的免疫调节物质，除了参与免疫调节外，细胞因子在肿瘤、免疫缺陷、自身免疫性疾病及组织代谢等方面也起到一定作用[14]。血清中免疫球蛋白和免疫细胞因子的浓度可以反映机体的免疫功能，它们在防止动物机体遭受病毒感染方面也发挥着重要作用[15]。IgA、IgM和IgG主要由动物脾脏和淋巴结中的浆细胞合成分泌，在机体特异性免疫中发挥重要作用[16]。IgG约占血清中总免疫球蛋白的75%，其在体液免疫中起到主要作用，可作为血清学诊断的抗体[17]。IgM在抗原刺激诱导体液免疫应答中最先产生。在机体早期防御中起着重要作用。血液中的免疫细胞因子浓度可以反映机体细胞免疫的状态[18]。IL-2是一种细胞生长因子，可以调控动物免疫系统中白血球的细胞活性，同时参与抗体反应，其主要作用是增强巨噬细胞和T淋巴细胞活性[19]。IL-4主要功能是诱导B细胞成熟并刺激其产生免疫球蛋白，对于体液免疫具有重要调节作用[20]。井霞[21]研究发现，冷应激状态下奶牛的免疫功能下降或遭到抑制；RYBAKINA等[22]报道冷暴露可使小鼠机体的体液免疫受到明显的抑制。本试验研究发现，冷应激状态下西门塔尔牛血清中IgA、IgG、IL-2和IL-4含量显著低于非应激状态，表明冷应激抑制了免疫球蛋白的合成，导致西门塔尔母牛体液免疫功能受损。这可能是由于本试验冬季试验期间在1月份，试验牛在草原上常年放牧，已遭受较长时间冷应激侵袭，长期冷应激刺激西门塔尔母牛机体生成多种血清免疫抑制因子，抑制了白细胞介素的产生，进而影响机体免疫球蛋白的合成，导致西门塔尔母牛免疫功能严重受损，IL-2的分泌水平对动物机体免疫球蛋白合成的抑制作用机制有待进行深入研究。

3.2 慢性冷应激对西门塔尔母牛抗氧化功能的影响冷应激状态下，机体的抗氧化平衡遭受破坏导致自由基大量产生，过量的氧自由基可诱导脂质过氧化反应的产生进而产生大量的脂质过氧化物，导致脂质过氧化作用增强，加剧机体遭受的氧化应激损伤[23]。抗氧化酶在清除机体内自由基及保护机体免受过氧化应激损伤方面发挥重要作用[24]。MDA是脂质过氧化的最终产物，其含量的高低可反映机体组织脂质过氧化的程度，是代表细胞损伤的指标之一[25]；SOD是酶促反应体系中重要的酶，在机体内的主要作用是清除超氧阴离子自由基进而防止细胞损伤，其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，T-AOC是衡量机体总抗氧化能力高低的重要指标[26-27]。有研究报道，慢性冷应激显著提高了蒙古牛血清中MDA含量[12]。孟祥坤等[28]通过研究慢性冷应激对西门塔尔犊牛的影响时，发现在-4.0℃日平均气温下，犊牛血清中MDA水平显著升高，SOD活性显著下降。有研究指出，大鼠在遭受冷应激初期，血清SOD活性升高，但持续遭受冷应激后，SOD活性下降[29]。本试验研究结果表明，冷应激导致西门塔尔母牛血清中MDA含量显著下降，T-AOC水平显著提高，而SOD活性无显著变化，表明冷应激对西门塔尔母牛抗氧化功能造成了影响，SOD活性无显著变化可能是由于试验牛在初冬遭受冷应激时，由于机体的代偿保护作用而升高，随着冷应激持续时间的延长，SOD活性下降，恰好在本试验冬季采样期间SOD活性下降到非应激状态水平，本试验组将在今年冬季进行长期监测冷应激状态下肉牛抗氧化能力的变化，进而对本试验中SOD活性结果的猜测进行验证。

3.3 慢性冷应激对西门塔尔母牛血清激素分泌的影响当动物遭受冷应激侵扰时，其主要的生理反应是通过增加产热以维持恒定的体温[30]。甲状腺激素是甲状腺分泌的激素，主要包括T3和T4。T4是甲状腺的主要分泌物，全部由甲状腺细胞产生；大部分T3由T4脱碘转变而成，其具有加强组织代谢，提高组织产热量及促进糖类吸收等作用[31]。甲状腺激素的合成和分泌受TSH的控制，其分泌过程与大脑皮层接受的外界刺激相关[32]。吴永魁[33]通过对仔猪进行冷应激处理后，发现血液中T3和T4含量均显著升高[12-13]。白丹丹等[34]通过比较不同季节对三河牛血液生化指标的影响，研究发现冬季冷应激状态下三河牛血清中T3和T4含量均显著高于春季非应激状态。另有研究报道，三河牛在遭受急性冷应激后，血清中T3和T4含量均显著升高[35]。本试验研究结果表明，冷应激状态下西门塔尔母牛血液中T3和T4含量相对于非应激期均显著升高，这与已有的研究报道一致，表明慢性冷应激通过激活HPT轴，提高了TSH分泌水平，进而导致T3和T4含量显著升高，从而增加产热以提高西门塔尔母牛对冬季草原低温环境的抵抗力。但在本试验研究中发现，冷应激状态下西门塔尔母牛血清中TSH含量与非应激状态下并无显著性差异，这可能是由于试验牛血液中T3和T4含量升高到一定水平后，通过负反馈作用抑制了TSH的合成与分泌，其作用机制有待进一步深入研究。ACTH是脑垂体前叶分泌的激素，其主要作用是增强肾上腺皮质合成并释放GC，GC普遍存在于动物的大脑和垂体内，通过调节机体各种代谢以维持内环境的恒定[36-37]。本试验结果表明，冷应激状态下西门塔尔母牛血清中ACTH和GC的分泌水平显著高于非应激状态，说明西门塔尔母牛在遭受慢性冷应激侵袭时，HPA轴被激活，促进ACTH和GC的分泌，增强肝糖原异生为机体提供能量，进而提高机体对寒冷环境的适应。由于动物机体各组织器官活动所需能量大部分来自葡萄糖，因此血液中葡萄糖需要保持一定浓度以维持机体需要[38]。王金涛等[39]研究发现，冷应激状态下雏鸡血浆葡萄糖含量显著升高。孟祥坤等[28]报道冷应激状态下西门塔尔犊牛血糖水平显著升高。梁鸿雁等[40]通过研究冷应激对荷斯坦奶牛的影响，得出了相同的结果。本试验结果表明，在冬季低温刺激下，西门塔尔母牛血清中葡萄糖含量显著升高，这可能是西门塔尔母牛遭受冷应激后，皮质酮水平升高进而促进蛋白质分解，糖异生作用加强引起的结果，为机体增加产热以对抗低温环境。GH是腺垂体细胞分泌的一类肽类激素，其主要生理作用是促进机体生长发育，并能够促进分化大多数免疫细胞[41]。本试验研究结果表明，冷应激期西门塔尔母牛血清中GH水平显著下降，GH的分泌受垂体的调节，可能是由于冷应激激活西门塔尔母牛机体HPT轴，导致其主要生理反应为增加机体产热而非生长，因此GH的合成和释放发生障碍。血清BUN水平可反映动物蛋白质代谢状况，蛋白代谢良好时其含量较低[42]。有研究报道冷应激导致肉牛糖代谢下降，进而促进氨基酸分解代谢产生大量尿素，从而血清中BUN含量增加[43]。本试验研究结果表明，冷应激对西门塔尔母牛血清中尿素氮含量无显著影响，可能是由于本试验的冬季试验期是在放牧肉牛遭受两个月的冷应激后进行的，机体逐渐适应了低温环境，蛋白的合成及分解都逐渐达到平衡，因此变化不显著。冷应激对肉牛血清BUN含量的影响机理，还有待进行深入研究。冷应激对西门塔尔母牛能力代谢也造成了一定的影响。

内蒙古草原冬季低温刺激使西门塔尔母牛遭受了较大的应激损伤，冷应激状态下的西门塔尔母牛血清中IgA、IgG、IL-2、IL-4、MDA及T-AOC浓度较非应激状态均产生了显著变化，表明冷应激显著降低了西门塔尔母牛的免疫功能和抗氧化功能。冷应激激活了草原放牧西门塔尔母牛HPA系统，使机体T3及T4均分泌增多以增加产热，从而提高西门塔尔母牛对寒冷环境的抵抗力和适应力。